| 研究課題/領域番号 |
19K07389
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| 研究機関 | 慶應義塾大学 |
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研究代表者 |
田井 育江 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 講師 (90749508)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | VEGFR2 / リン酸化VEGFR2 / VEGFR2切断断片 / Tspan / Tetraspanin |
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| 研究実績の概要 |
生後6.5日目の野生型マウスおよび全身でTspan18を欠損するマウスの網膜、腸間膜、鼠径部～腹部の大動静脈について、VEGFR2とリン酸化VEGFR2(pR2)の発現状況をウエスタンブロットにより確認した。その結果、いずれの組織でも多量の全長VEGFR2と少量のVEGFR2 75kDa断片が検出され、130kDa断片は検出されなかった。野生型マウスとTspan18欠損マウスにおいて、75kDa断片の量はいずれの組織でもほぼ同等であった。pR2は全長のみが網膜で検出され、野生型マウスよりTspan18欠損マウスで多く検出された。Tspan18欠損マウスでは生後の血管形成が遅延するため、この結果は、組織を採取したP6.5の時点において、野生型マウスよりTspan18欠損マウスの方が、網膜の血管新生がより強く起こる血管形成段階にあったためと考えられる。
一方、HUVECにおいてVEGFR2を強制発現したところ、全長VEGFR2が増加しただけでなく、75kDa断片の量がより大きく増加した。また、細胞内断片と推定される約40kDaのバンドも増加した。トランスフェクションするDNAを増やしても全長VEGFR2の量は頭打ちとなり、それ以上は増加しなかった。
Tspan18を強制発現したHUVECでは、VEGF処理後に生じるVEGFR2 75kDa断片の増加が起こらず、同断片は処理後に徐々に減少した。Tspan18はVEGFR2の75kDa断片と結合するため、Tspan18がVEGF処理後の75kDa断片の産生あるいは完全分解からの保護に寄与している可能性が示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
野生型マウスおよびTspan18欠損マウスを用いて、血管を含む複数の組織で全長VEGFR2およびその断片、およびそれらのリン酸化物を探索したが、検出されたVEGFR2の多くは全長VEGFR2であった。これに加え、全長より量は少ないが75kDa断片も検出されており、今後それらを対象に解析を行うことが可能である。
過去にHUVECにおいてTspan18のsiRNAノックダウンを行い、VEGF刺激後のVEGFR2の断片の生成を調べているが、今回はTspan18を強制発現した際の断片の挙動について知見が得られた。なお、Tspan18をsiRNAノックダウンした際の挙動には、用いるsiRNA配列によってバラつきが観察されるため、強制発現あるいはノックアウトマウスに由来する血管内皮を使った解析結果を蓄積する必要がある。
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| 今後の研究の推進方策 |
Tspan18をsiRNAノックダウンした場合と強制発現した場合でVEGFR2断片の挙動を比較しているが、両実験の結果は単純な表裏の関係にはないと見られることから、今後の研究に工夫が必要である。まず、Tspan18欠損マウスから単離した血管内皮細胞(肺由来血管内皮等)を用い、野生型マウス由来の同細胞との間でVEGFR2の切断とリン酸化を比較する。次に、新しく導入したエレクトロポレーションを用いた遺伝子導入を行うことで、Tspan18の強制発現を高効率で実現し、再度断片の評価を行う。
また、膜タンパク質のsheddingを担う酵素のノックアウトマウスを入手してVEGFR2断片の生成状況を確認する実験、あるいは、VEGFR2の予想切断配列の周囲に変異を導入することで、切断を受けない変異体を得る実験についても実施を計画している。
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