| 研究課題/領域番号 |
19K07402
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| 研究機関 | 山口大学 |
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研究代表者 |
瀧井 良祐 山口大学, 大学院医学系研究科, 助教 (00419558)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | 熱ショック応答 / 転写 / HSF / DNAプルダウン法 / 進化 |
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| 研究実績の概要 |
研究代表者は、DNAプルダウンアッセイとプロテオーム解析を基盤とした手法により、HSF1転写複合体の構成因子を同定した。まず進化的アプローチにより、HSF1のDBD領域にある１アミノ酸と、領域X内の22アミノ酸が活性化に必要であることを明らかにした。そこで、野生型および変異型HSF1を用いHSF1転写複合体の構成因子群をプロテオーム解析により明らかにした。約200の因子を同定し、その中にはHSF1の転写活性と相関して、結合量が変化する因子群が複数存在した。その中には、既知だけでなく、新規のHSF1相互作用タンパク質が数多く見つかった。そこで、これらの中から11因子に着目し、ノックダウンを行い、熱依存的なHSP70の誘導能の変化を調べた。その結果、5因子がHSP70誘導能の低下を引き起こした。そこで研究代表者は、染色体分配関連因子に着目した。同因子は、熱刺激時の転写との関連について報告はない。この因子は、熱刺激時にHSF1依存的にHSP70プロモーター領域へ呼び込まれることが分かった。また、この因子は、様々なマウスの細胞においても、熱依存的なHSP70の誘導に必要であることがわかった。さらに、熱依存的な細胞死についても、同因子のノックダウンは、強い細胞死の誘導とユビキチンタンパク質の蓄積の上昇が見られ、熱依存的なプロテオスタシスの維持に必要であることがわかった。今後は、この因子がどのようにHSP70の転写誘導を活性化するのか、相互作用タンパク質の解析を網羅的に行い、その分子機構を明らかにしたい。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
染色体分配関連因子SGO2は、マウス線維芽細胞MEFにおいて熱刺激依存的なHSP70の発現に必要であった。また、タンパク質毒性ストレス条件下（亜ヒ酸ナトリウム、プロリンアナログ、プロテアソーム阻害剤）におけるHSP70の発現においてもSGO2は、重要な促進因子であることがわかった。さらにマウスSGO2に対する抗体を作成し、HSF1との相互作用を調べた結果、熱刺激化においてのみHSF1とSGO2の相互作用を確認できた。また、様々な両者の領域欠損変異体を作成し、HSF1とSGO2の相互作用に必要な領域を決定した。SGO2は熱刺激依存的にクロマチン免疫沈降法によるHSP70プロモーター部位への集積が見られた。またその集積は、HSF1欠損で見られなくなることからHSF1依存的にSGO2がHSP70プロモーターへ集積することがわかった。また、HSF1またはSGO2の相互作用できない変異体を用いた解析では、両者の相互作用が見られなくなり、またHSP70プロモーターへの集積も見られなくなった。
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| 今後の研究の推進方策 |
マウスSGO2が熱依存的なHSP70発現に必要な因子であることがわかった。同時にHSP70プロモーターへの集積も見られることから、HSF1の転写のコアクチベーターであることがわかる。一方で、SGO2は一般的な転写のコアクチベーターとしての報告はない。そこで、SGO2の相互作用タンパク質を網羅的に解析し、転写の促進因子を同定しなければならない。ヒトSGO1による相互作用タンパク質の網羅的解析から、RNA ポリメラーゼIIが同定され、ノンコーディングRNAの転写に関わることが報告されている。このような強力な転写の促進因子が同定できることを期待する。熱依存的な転写の促進因子を同定するために、熱刺激あり、５分、１０分の核抽出液を調整し、抗SGO2抗体を用いた免役沈降を行い、SGO2の相互作用タンパク質をMASスペクトロメトリーを用い解析を行う。また、熱による細胞死、細胞内ユビキチン化タンパク質の蓄積、を解析する。さらに、マウスだけではなく、ヒトSGOファミリー分子群が熱刺激依存的な遺伝子発現に関わることを確認する。最終的にはマウス、ヒトSGOが染色体分配だけでなく、転写の促進因子として働くことを明らかにしたい。
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