研究課題
下垂体は生体の内分泌機能を制御し、恒常性の維持と機能調節を行う。機能不全に対する治療は不足ホルモンの補充であるが、生体のフィードバック機構に対応するホルモン量の調節は困難である。適切に生体で機能する下垂体の再生医療実現を目標に、研究分担者はヒトiPS細胞から下垂体構成細胞を多種含む組織塊の三次元培養を世界に先駆け成功させた。本研究では、ヒトiPS細胞が下垂体組織に分化していく過程を、電顕を用いた細胞内小器官などの形態学的変化に注目した検討と免疫電顕を用いたタンパク発現解析を加えて観察し、内分泌細胞の成熟・分化とは何か？を問う。正常組織との形態学的な類似性だけでなく機能に注目し、再生医療に臨床応用する生きた細胞の評価に対する形態学的なアプローチの基礎を確立する。比較に、外科的に切除された下垂体腫瘍や周囲非腫瘍性下垂体組織を用いることで、腫瘍細胞の分化度や薬物治療後の内分泌細胞の変化の超微形態学的対比も行う。iPS細胞は、臓器発生を可能とする環境を模倣する培養で分化させていくが、多方向分化の可能性があるため、実際に成熟してきた細胞が、果たしてどのような機能を持った細胞であるのか、混在する他種の細胞があるのか、真に目的とする細胞ができているのか、正確に把握する。iPS細胞由来組織塊を医療に応用するためには、生きた安全性の確保された細胞塊のまま、評価を行う必要がある。直接的に加えられる形態学的評価方法の確立の必要性を見据えて、早急に取り組むべき、多領域が融合する、新規の開拓分野に位置する研究である。
2: おおむね順調に進展している
研究分担者が作成した下垂体組織集塊を、50日ごとに標本を作製し、一年間の成熟過程を観察した。3次元構造すなわち嚢胞様の構造を呈する頃には表面には上衣分化、内部には紡錘形細胞が出現する系が確認された。培養細胞塊に『向き』があること、内分泌細胞で細胞の細胞ごとに成熟度に幅があり、細胞にも極性があることも確認した。集塊によりアポトーシス頻度が高く単純に嚢胞構造を呈し、分化が進んでいないことがあり、刺激や遺伝子操作によりその頻度が異なる。【具体的に本期間で行ったこと】① 各細胞集塊に、光学レベルで連続切片を作成した。作成した連続切片は30枚程度ごと（光学標本はおよそ3ミクロンであるため約100ミクロンごとに同じ染色を加えたことになる）にHE染色や免疫染色（内分泌分化を見るSynatophysin、ChromograninA、前葉ホルモンであるACTH, GH, PRL, TSH, FSH, LH、前葉細胞分化を規定する転写因子Tpit、SF1、Pit1、ER、後葉細胞を同定するTTF-1、上衣細胞を同定するEMA、組織球を同定するPGM1、神経成分やグリアの確認のためS100、GFAP、細胞内骨格パターン認識のためCAM5.2、細胞分裂期を認識し増殖帯の部位を確認できるMIB1）を加えた。分化した集塊は、アポトーシスが進んだ集塊よりもMIB1陽性率が低く、陽性細胞の分布にも集塊の向きが見られた。② 内分泌細胞の成熟は、電顕により超微構造を観察した。表層細胞の上衣分化は、表面にみられる線毛に9+2構造が認められたことから同定できた。電顕では標本作製可能な検体の大きさが1㎜程度であり、全体像を1つの樹脂ブロックで把握することが困難で、複数個の集塊を安定して使用する必要があることが分かった。
想像以上に集塊ごとに成熟の程度が異なり、びまん性にMIB-1陽性細胞は分布している集塊がある一方、ホルモン分泌細胞が並ぶ領域と神経性成分が充実性に造成する部分がひょうたん型に領域性をもって成長している集塊も見られた。このような嚢胞の形成、ひょうたん型の分化成熟は、比較的早い時期から起こる。病理形態学的な成長グラフを作れるような指標、例えば、大きさ（血管などがないため限界が存在する）、分化した細胞各成分の出現度合い構築することが必要である。①ホルマリン固定組織標本は安価で一度に多数の観察が可能であることから、共同研究者らが作成する下垂体組織のスクリーニングにどのように生かせるか、検討していく。また、免疫染色では今までに、前葉細胞の分化を中心に検索してきたが、視床下部後葉系の細胞の成熟度を測るタンパクの検討を追加する。②電顕標本は、1㎜の大きさを標本として確保することが困難であり、十分に成長した組織集塊全体像を1つの樹脂包埋ブロックで観察することが困難であった。これを克服するためには複数の、同じように分化した集塊が必要であるが、一方、成熟途中で培養を止め固定させる集塊を多くとすることは、共同研究者の研究遂行への負担につながるため、各検討に対し組織検索標本作製を行う適切な集塊数の設定が必要である。また免疫電顕手法を用いた検討のため、固定法や金コロイド吸着のタイミング等、再検討中である。
2020年トルコで開催されたInternational pituitary pathology club meetingに、台風による飛行機欠航のため参加できなかった。2020年4月に研究室を異動したため、立ち上げにしばらくの時間を要した。そのほかは順調に計画が進んでいる。
すべて 2020
すべて 雑誌論文 (2件) (うち査読あり 1件、 オープンアクセス 1件) 学会発表 (1件) 図書 (1件)
Cell Reports
巻: 30 ページ: 18-24
10.1016/j.celrep.2019.12.009.
病理と臨床 臨時増刊号
巻: 38 ページ: 198-203
