去勢抵抗性前立腺癌に対する新規免疫療法の確立に目指した腫瘍免疫機構の解明

2021 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 19K07486
• 研究機関: 名古屋市立大学
• 研究代表者: 高橋 智 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 教授 (60254281)
• 研究分担者: 内木 綾 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 准教授 (20509236) ; 加藤 寛之 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 講師 (80791293)
• 研究期間 (年度): 2019-04-01 – 2023-03-31
• キーワード: 去勢抵抗性前立腺癌

研究実績の概要

正常免疫を有するラットにおいても生着可能なラット前立腺細胞PLS10からmRNAを抽出し、作成したcDNA群をエントリーベクターに組み込みcDNAライブラリーを作成した。さらにcDNAライブラリーをレンチウイルスベクターに組み替え、cDNA発現ライブラリーを作成した。この発現ライブラリーをレンチウイルスにパッケージングし、PLS30に感染させた。セレクションマーカーであるブラストサイジン存在下で細胞を培養したところ細胞増殖がみられなかった。
PLS10、PLS20、PLS30のマイクロアレイ解析からPLS10のみ高発現がみられた遺伝子を9種類（Cd81、Ccl2、Cx3cl1、Ifi44、Pycard、Nradd、Tmem9、Ubxd8、Tmem252）見いだし、qRT-PCR法を用いて検討したところ、Cd81、Ccl2、Cx3cl1、Nradd、Tmem252の5遺伝子はmRNA量がPLS10のみ増加していることを確認した。この5遺伝子の中からCd81についてさらに検討した。PLS10、PLS30のCd81タンパク発現量を比較し、PLS10のみで高発現していることを確認した。これらを踏まえ、Cd81発現ベクターを作成し、PLS30に遺伝子導入した。PCR法によりFLAG-Cd81融合タンパク質を作成し、レンチウイルスベクターに組み込み、PLS30に導入してCd81発現安定株を樹立した。Cd81を導入したPLS30は優位に細胞増殖速度が増加していた。Cd81-PLS30および対照であるlacZ-PLS30をそれぞれ2×106個をF344ラット前立腺腹葉に移植した。20週以上経過しても前立腺内に腫瘍形成は見られず、Cd81は細胞増殖には寄与しているものの免疫回避機構には関与していないことが明らかとなった。

現在までの達成度 (区分)

4: 遅れている

理由

正常免疫を有するラットにおいても生着可能なラット前立腺細胞PLS10からmRNAを抽出し、作成したcDNA群をエントリーベクターに組み込みcDNAライブラリーを作成した。さらにcDNAライブラリーをレンチウイルスベクターに組み替え、cDNA発現ライブラリーを作成した。この発現ライブラリーをレンチウイルスにパッケージングし、PLS30に感染させた。セレクションマーカーであるブラストサイジン存在下で細胞を培養したところ細胞増殖がみられなかった。良質なウイルスが作成されなかった可能性があり、パッケージングをやり直す必要がある。
PLS10、PLS20、PLS30のマイクロアレイ解析からPLS10のみで高発現している遺伝子（Cd81、Ccl2、Cx3cl1、Ifi44、Pycard、Nradd、Tmem9、Ubxd8、Tmem252）を抽出し、PLS10、PLS20、PLS30細胞それぞれにおけるこれらの遺伝子発現量をqRT-PCR法を用いて検討し、Cd81、Ccl2、Cx3cl1、Nradd、Tmem252の5遺伝子についてPLS10のみで高いmRNA発現量が確認できた。そこで最初にCd81発現ベクターを作成してCd81安定発現PLS30を樹立した。Cd81-PLS30および対照であるlacZ-PLS30をそれぞれ2×106個をF344ラット前立腺腹葉に移植して腫瘍生着の有無を検討したが、20週以上経過しても前立腺内に腫瘤形成は見られず、Cd81は細胞増殖には寄与しているものの免疫回避機構には関与していないことが判明し、他の遺伝子について検討を進める必要がある。

今後の研究の推進方策

(1) 遺伝子発現ライブラリー作成における組み換え効率を向上させるために、ベクター組み換え酵素であるLR Clonase反応時間の調節、cDNA作成時における温度、時間についても検討する。組み換え効率が50%以上に向上したcDNA発現ライブラリーを樹立できた場合には、これをPLS30に遺伝子導入し、PLS10 cDNAライブラリー発現PLS30細胞をラット腹葉前立腺に同種同所移植して腫瘍形成の有無について検討していく。
(2) Cd81が癌細胞の免疫回避機構に関与していないことが明らかになったため、他の候補遺伝子（Ccl2、Cx3cl1、Nradd、Tmem252、Pycard）に焦点を当てて検討を進めていく。特にcytokineとして免疫に関与するCcl2, Cx3cl1については優先的に発現ベクター構築を進め、PLS30における発現安定株を作成してラット前立腺に同種同所移植し、腫瘍形成の有無を検討していく。また、cell cycle assayやinvasion assayを行い、in vitroにおける形質転換の有無を検討する。
(3) PLS10, PLS30はいずれもF344ラット前立腺腹葉に移植後数日間は腫瘍形成がみられ、背景には高度の炎症細胞浸潤が見られることを確認している。そこでPLS10あるいはPLS30移植後7日目のラット前立腺凍結組織およびパラフィン包埋組織を採取し、photo-isolation chemistryを用いて癌細胞移植部位の微小環境における空間的トランスクリプトームを解析して、どのような発現遺伝子が癌細胞の免疫回避に直接関与しているのかを検討する。

次年度使用額が生じた理由

2021年4月から研究科長に就任したために大学運営に関わる会議等に参加することが非常に多くなり、腰を据えて研究に取り組める時間が極端に減少してしまった。今後も会議等に時間が割かれることが多くなることが予想されるため、教室員の支援を受けて研究を進めていきたいと考えている。
Cd81がPLS10細胞の免疫回避機構に関与していないことが明らかになったが、他の候補遺伝子の発現ベクターの構築はほぼ完了しており、順次ラットに同種同所移植を実施していく予定である。
PLS10, PLS30はいずれもF344ラット前立腺腹葉に移植後数日間は腫瘍形成がみられ、背景には高度の炎症細胞浸潤が見られることを確認している。現在までにPLS10あるいはPLS30移植後7日目のラット腹葉前立腺凍結組織およびパラフィン包埋組織を採取しており、今後はphoto-isolation chemistryを用いて癌細胞移植部位の微小環境における空間的トランスクリプトームを解析して、どのような発現遺伝子が癌細胞の免疫回避に直接関与しているのかを検討していく。

研究成果

• [雑誌論文] Protective effects of tadalafil on damaged podocytes in an adriamycin-induced nephrotic syndrome model. (2022)
  • 著者名/発表者名: Tomita, N., Hotta, Y., Naiki-Ito, A., Sanagawa, A., Kataoka, T., Furukawa-Hibi, Y., Takahashi, S., Kimura, K.
  • 雑誌名: Journal of Pharmacological Sciences 巻: 149 ページ: 53-59
  • DOI: 10.1016/j.jphs.2022.03.003
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Assessment of the toxicity and carcinogenicity of double-walled carbon nanotubes in the rat lung after intratracheal instillation: a two-year study. (2022)
  • 著者名/発表者名: Saleh, D.M., Luo, S., Ahmed, O.H.M., Alexander, D.B., Alexander, W.T., Gunasekaran, S., El-Gazzar, A.M., Abdelgied, M., Numano, T., Takase, H., Ohnishi, M., Tomono, S., El Hadi, R.H.A., Fukamachi, K., Kanno, J., Hirose, A., Xu, J., Suzuki, S., Naiki-Ito, A., Takahashi, S., Tsuda, H.
  • 雑誌名: Particle abd Fibre Toxicology 巻: 19 ページ: -
  • DOI: 10.1186/s12989-022-00469-8
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Low HECTD1 mRNA expression is associated with poor prognosis and may be correlated with increased mitochondrial cellular respiratory function in breast cancer. (2022)
  • 著者名/発表者名: Uemoto, Y., Katsuta, E., Kondo, N., Wanifuchi-Endo, Y., Fujita, T., Asano, T., Hisada, T., Terada, M., Kato, A., Okuda, K., Sugiura, H., Kato, H., Osaga, S., Takahashi, S., Toyma, T.
  • 雑誌名: American Journal of Cancer Research 巻: 12 ページ: 1593-1605
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] The complete loss of p53 expression uniquely predicts worse prognosis in colorectal cancer. (2022)
  • 著者名/発表者名: Nagao, K., Koshino, A., Sugimura-Nagata, A., Nagano, A., Komura, M., Ueki, A., Ebi, M., Ogasawara, N., Tsuzuki, T., Kasai, K., Takahashi, S., Kasugai, K., Inaguma, S.
  • 雑誌名: International Journal of Molecular Science 巻: 23 ページ: -
  • DOI: 10.3390/ijms23063252
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] SPATA18 expression predicts favorable clinical outcome in colorectal cancer. (2022)
  • 著者名/発表者名: Sugimura-Nagata, A., Koshino, A., Nagao, K., Nagano, A., Komura, M., Ueki, A., Ebi, M., Ogasawara, N., Tsuzuki, T., Kasai, K., Takahashi, S., Kasugai, K., Inaguma, S.
  • 雑誌名: International Journal of Molecular Science 巻: 23 ページ: -
  • DOI: 10.3390/ijms23052753
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Peripheral neuropathy in the pre-diabetic state of the type 2 diabetes mouse model (TSOD mice) involves TRPV1 expression in dorsal root ganglions. (2022)
  • 著者名/発表者名: Shida, K., Ohsawa, M., Takahashi, S., Ota, H., Tamura, T., Kusama, N., Nakasone, M., Yamazaki, H., Sobue, K.
  • 雑誌名: IBRO Neuroscience Reports 巻: 12 ページ: 163-169
  • DOI: 10.1016/j.ibneur.2022.02.001
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] The risk analyses of lymph node metastasis and recurrence for submucosal invasive colorectal cancer: Novel criteria to skip completion surgery. (2022)
  • 著者名/発表者名: Ozeki, T., Shimura, T., Ozeki, T., Ebi, M., Iwasaki, H., Kato, H., Inaguma, S., Okuda, Y., Katano, T., Nishie, H., Takahashi, S., Kataoka, H.
  • 雑誌名: Cancers 巻: 14 ページ: -
  • DOI: 10.3390/cancers14030822
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Exercise-induced extracellular vesicles delay the progression of prostate cancer. (2022)
  • 著者名/発表者名: Sadovska, L., Auders, J., Keisa, L., Romanchikova, N., Silamikele, L., Kreismane, M., Zayakin, P., Takahashi, S., Kalnina, Z., Line, A.
  • 雑誌名: Frontiers in Molecular Biosciences 巻: 8 ページ: -
  • DOI: 10.3389/fmolb.2021.784080
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Relevance of gene mutations and methylation to the growth of pancreatic intraductal papillary mucinous neoplasms based on pyrosequencing. (2022)
  • 著者名/発表者名: Asano, G., Miyabe, K., Kato, H., Yoshida, M., Sawada, T., Okamoto, Y., Sahashi, H., Atsuta, N., Kachi, K., Kato, A., Jinno, N., Natsume, M., Hori, Y., Naitoh, I., Hayashi, K., Matsuo, Y., Takahashi, S., Suzuki, H., Kataoka, H.
  • 雑誌名: Scientific Reports 巻: 12 ページ: -
  • DOI: 10.1038/s41598-021-04335-z
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] PBK enhances cellular proliferation with histone H3 phosphorylation and suppresses migration and invasion with CDH1 stabilization in colorectal cancer. (2022)
  • 著者名/発表者名: Koshino, A., Nagano, A., Ota, A., Hyodo, T., Ueki, A., Komura, M., Sugimura-Nagata, A., Ebi, M., Ogasawara, N., Kasai, K., Hosokawa, Y., Kasugai, K., Takahashi, S., Inaguma, S.
  • 雑誌名: Frontiers in Pharmacology 巻: 12 ページ: -
  • DOI: 10.3389/fphar.2021.772926
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Discovering novel mechanisms of taxane resistance in human breast cancer by whole-exome sequencing. (2022)
  • 著者名/発表者名: Wanifuchi-Endo, Y., Kondo, N., Dong, Y., Fujita, T., Asano, T., Hisada, T., Uemoto, Y., Nishikawa, S., Katagiri, Y., Kato, A., Terada, M., Sugiura, H., Okuda, K., Kato, H., Takahashi, S., Toyama, T
  • 雑誌名: Oncology Letters 巻: 23 ページ: -
  • DOI: 10.3892/ol.2021.13178
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Identification of microRNA-96-5p as a postoperative, prognostic microRNA predictor in non-viral hepatocellular carcinoma. (2022)
  • 著者名/発表者名: Matsui, T., Hamada-Tsutsumi, S., Naito, Y., Nojima, M., Iio, E., Tamori, A., Kubo, S., Ide, T., Kondo, Y., Eguchi, Y., Komori, A., Morine, Y., Shimada, M., Utsunomiya, T., Shirabe, K., Kimura, K., Hiasa, Y., Chuaypen, N., Tangkijvanich, P., Naiki-Ito, A., Takahashi, S., Ochiya, T., Tanaka, Y.
  • 雑誌名: Hepatology Research 巻: 52 ページ: 93-104
  • DOI: 10.1111/hepr.13674
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Lactoferrin prevents hepatic injury and fibrosis via inhibition of NF-kB signaling in a rat non-alcoholic steatohepatitis model. (2022)
  • 著者名/発表者名: Aoyama, Y., Naiki-Ito, A., Xiaochen, K., Komura, M., Kato, H., Nagayasu, Y., Inaguma, S., Tsuda, H., Tomita, M., Matsuo, Y., Takiguchi, S., Takahashi, S.
  • 雑誌名: Nutrients 巻: 14 ページ: -
  • DOI: 10.3390/nu14010042
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] PBK expression predicts favorable survival in colorectal cancer patients. (2021)
  • 著者名/発表者名: Nagano-Matsuo, A., Inoue, S., Koshino, A., Ota, A., Nakao, K., Komura, M., Kato, H., Naiki-Ito, A., Watanabe, K., Nagayasu, Y., Hosokawa, Y., Takiguchi, S., Kasugai, K., Kasai, K., Inaguma, S., Takahashi, S.
  • 雑誌名: Virchows Archiv 巻: 479 ページ: 277-284
  • DOI: 10.1007/s00428-021-03062-0
  • 査読あり
• [雑誌論文] Anti-allergic drug suppressed pancreatic carcinogenesis via down-regulation of cellular proliferation. (2021)
  • 著者名/発表者名: Kachi, K., Kato, H., Naiki-Ito, A., Komura, M., Nagano-Matsuo, A., Naitoh, I., Hayashi, K., Kataoka, H., Inaguma, S., Takahashi, S.:
  • 雑誌名: International Journal of Molecular Sciences 巻: 22 ページ: -
  • DOI: 10.3390/ijms22147444
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Suppressive effect and molecular mechanism of Houttuynia cordata Thunb. Extract against prostate carcinogenesis and castration-resistant prostate cancer. (2021)
  • 著者名/発表者名: Subhawa, S., Naiki-Ito, A., Kato, H., Naiki, T., Komura, M., Nagano-Matsuo, A., Yeewa, R., Inaguma, S., Chewonarin, T., Banjerdpongchai, R., Takahashi, S.
  • 雑誌名: Cancers 巻: 13 ページ: -
  • DOI: 10.3390/cancers13143403
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] DPYD, down-regulated by the potentially chemopreventive agent luteolin, interacts with STAT3 in pancreatic cancer. (2021)
  • 著者名/発表者名: Kato, H., Naiki-Ito, A., Suzuki, S., Inaguma, S., Komura, M., Nakao, K., Naiki, T., Kachi, K., Kato, A., Matsuo, Y., Takahashi, S.
  • 雑誌名: Carcinogenesis 巻: 42 ページ: 940-950
  • DOI: 10.1093/carcin/bgab017
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Enhanced effect of chemotherapy by cancer-specific targeting of taurine upregulated gene 1 in pancreatic cancer. (2021)
  • 著者名/発表者名: Tasaki, Y., Suzuki, M., Katsushima, K., Shinjo, K., Iijima, K., Murofushi, Y., Naiki-Ito, A., Hayashi, K., Qui, C., Takahashi, A., Tanaka, Y., Kawaguchi, T., Sugawara, M., Kataoka, T., Naito, M., Miyata, K., Kataoka, K., Noda, T., Gao, W., Kataoka, H., Takahashi, S., Kimura, K., Kondo, Y.
  • 雑誌名: Cancer Research 巻: 81 ページ: 1654-1666
  • DOI: 10.1158/0008-5472.CAN-20-3021
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Osteosarcoma-derived small extracellular vesicles enhance tumor metastasis and suppress osteoclastogenesis by miR-146a-5p. (2021)
  • 著者名/発表者名: Araki, Y., Aiba, H., Yoshida, T., Yamamoto, N., Hayashi, K., Takeuchi, A., Miwa, S., Igarashi, K., Nguyen, T.D., Ishii, K., Nojima, T., Takahashi, S., Murakami, H., Tsuchiya, H., Hanayama, R.
  • 雑誌名: Frontiers in Oncology 巻: 11 ページ: -
  • DOI: 10.3389/fonc.2021.667109
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] ラット非アルコール性脂肪肝炎に対する紫米抽出物の化学予防効果 (2022)
  • 著者名/発表者名: 内木綾、加藤寛之、小村理行、高橋智
  • 学会等名: 第38回日本毒性病理学会総会および学術集会
• [学会発表] 膵癌におけるDPYD発現の寄与と発現抑制貴女の検討 (2022)
  • 著者名/発表者名: 加藤寛之、内木綾、小村理行、高橋智
  • 学会等名: 第38回日本毒性病理学会総会および学術集会
• [学会発表] Short term pulmonary toxicity study of carbon nano-horns (CNH) and carbon nano-brushes (CNB) using intratracheal method. (2022)
  • 著者名/発表者名: Saleh Dina, Ahmed Omnia, Alexander David, Alexander William, Gunasekaran Sivagami, Takamasa Numano, Hiroshi Takase, Makoto Ohnishi, Satoru Takahashi, Masako Yudasaka, Hiroyuki Tsuda
  • 学会等名: 第38回日本毒性病理学会総会および学術集会
• [学会発表] Evaluation of lung carcinogenicity of single-walled carbon nanotube (SWCNT) compared with MWCNT-7 and MWCNT-N. (2022)
  • 著者名/発表者名: Sheema Asraful Nahar, Aya Naiki-Ito, Hiroyuki Kato, Masayuki Komura, Hiroyuki Tsuda, Satoru Takahashi
  • 学会等名: The 1st Meeting of Asian Union of Toxicologic Pathology
  • 国際学会
• [学会発表] LuteolinはmTORシグナルとp21発現の制御により膀胱発がんを抑制する (2021)
  • 著者名/発表者名: 内木綾、加藤寛之、小村理行、長野愛矢、稲熊真悟、高橋智
  • 学会等名: 第110回日本病理学会総会
• [学会発表] CD70およびPD-L1は協調して悪性胸膜中皮腫細胞の免疫逃避を亢進させ、その予後を悪化させる (2021)
  • 著者名/発表者名: 稲熊真悟、長野愛矢、小村理行、加藤寛之、内木綾、高橋智
  • 学会等名: 第110回日本病理学会総会
• [学会発表] 大腸癌細胞におけるPBK発現は大腸癌患者の予後良好因子である (2021)
  • 著者名/発表者名: 長野愛矢、中尾健寿、内木綾、笠井謙次、稲熊真悟、高橋智
  • 学会等名: 第110回日本病理学会総会
• [学会発表] エラグ酸の膵発癌抑制効果の検討 (2021)
  • 著者名/発表者名: 加藤寛之、内木綾、稲熊真悟、小村理行、長野愛矢、高橋智
  • 学会等名: 第110回日本病理学会総会
• [学会発表] Novel selective lysine-specific demethylase 1 inhibitors, NCL1 and NCD38, suppress testicular tumor cell proliferation. (2021)
  • 著者名/発表者名: Etani, T., Naiki, T., Shimizu, N., Noda, Y., Nagai, T., Nozaki, S., Iida, K., Ando, R., Kawai, N., Takahashi, S., Suzuki, T., Yasui, T.
  • 学会等名: AUA Annual Meeting 2021
  • 国際学会
• [学会発表] Evaluation of testicular toxicity with the novel epigenome therapeutic agent NCL1. (2021)
  • 著者名/発表者名: Nozaki, S., Naiki, T., Iwatsuki, S., Naiki-Ito, A., Takeda, T., Etani, T., Umemoto, Y., Takahashi, S., Yasui, T.
  • 学会等名: AUA Annual Meeting 2021
  • 国際学会
• [学会発表] Luteolin suppresses squamous differentiation of bladder cancer and cancer growth via regulation of mammalian target of rapamycin pathway. (2021)
  • 著者名/発表者名: Iida, K., Naiki-Ito, A., Nagai, T., Nozaki, S., Etani, T., Naiki, T., Kawai, N., Takahashi, S., Yasui, T.
  • 学会等名: AUA Annual Meeting 2021
  • 国際学会
• [図書] 名市大ブックス5 医療の知識で自分を守る (2021)
  • 著者名/発表者名: 高橋智 (分担）
  • 総ページ数: 159
  • 出版者: 中日新聞社
  • ISBN: 978-4-8062-0776-4