| 研究課題/領域番号 |
19K07497
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| 研究機関 | 秋田大学 |
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研究代表者 |
大森 泰文 秋田大学, 医学系研究科, 教授 (90323138)
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| 研究分担者 |
山本 洋平 秋田大学, 医学部附属病院, 助教 (70400512)
西島 亜紀 藤田医科大学, 医学部, 講師 (40566105) [辞退]
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | 小胞体ストレス応答 / コネキシン / ギャップ結合 / がん幹細胞 / 放射線耐性 / パネキシン |
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| 研究実績の概要 |
令和２年度は、以下の３つの点について研究を進めた。
①ゴルジ体におけるCxタンパクの量体状態を明らかにする・・・ゴルジ体に局在するCxタンパクがいかなるフォームで存在しているのか、６量体を形成しチャネルのフォームで局在しているのか、単量体で浮遊しているのか等を知るために、透過電顕による観察、および免疫電顕による確認を行った。その結果、細胞膜への輸送が行われずCx32がゴルジ体に貯留しているHuH7細胞や、ゴルジ体停留シグナルを付加した変異Cx26タンパクを過剰発現させたFaDu下咽頭癌細胞においては、Cx32やCx26は6量体を形成しておらず、おそらく単量体で存在していることが示唆された。一方、Cx43の細胞膜への輸送が正しくなされるIAR20細胞においては、Cx43の一部がゴルジ体において6量体を形成していることが分かった。
②CxタンパクとS1PやS2PもしくはATF6αとの相互作用の検討・・・ゴルジ体に局在するCxタンパクが、S1PやS2Pプロテアーゼと相互作用し、ATF6αの活性化（断片化）を促進している可能性を探るために、免疫沈降法で両者の結合を検討したところ、ゴルジ体停留シグナルを付加した変異Cx26タンパクを過剰発現させたFaDu細胞においては、変異Cx26が完全長ATF6α、すなわち不活化型ATF6αと共沈することが確認された。一方、変異Cx26とS1PおよびS2Pとの結合は確認できなかった。おそらく、ゴルジ体に局在するCx26は不活化型のATF6αと結合し、S1PやS2PによるATF6αの断片化を受けやすくしている可能性が示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
放射線ストレスに対する適応応答能とCSCを同時に評価するための単一マーカーとして、CD98hcを同定することができ、これをまとめた論文が査読のある国際誌に掲載された。受理された[Kawasaki, *Omori et al., Arch. Med. Sci. DOI: https://doi.org/10.5114/aoms.2020.92872 *corresponding author]。これは本研究を推進するうえで、非常に有用な検出系となることが期待される。
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| 今後の研究の推進方策 |
①ゴルジ体におけるCxタンパクの詳細な局在を明らかにする・・・Cxタンパクの局在がゴルジ体なのか小胞体‐ゴルジ中間区画(ERGIC)なのか、ゴルジ体ならばゴルジ体膜なのかゴルジ基質なのかを決定するために超解像顕微鏡を用いて検討する。
②ゴルジ体Cxタンパクによるゴルジ基質内Ca2+濃度の変化の解析・・・PanxがER膜上にチャネルを形成するように、Cxがゴルジ膜上でチャネルを形成している場合、ゴルジ体Cxがゴルジ基質内のCa2+濃度を制御し、タンパク間相互作用を介することなくS1PやS2Pの活性に影響を与える可能性がある。そこで、ゴルジ体Cxの量の多寡で、ゴルジ基質内のCa2+濃度に変化がみられるかどうか、Ca2+プローブを用いて測定する。
③ゴルジ体Cxタンパクによる適応応答惹起の確認・・・ゴルジ体停留シグナルを付加した変異Cx26タンパクを過剰発現させ、ゴルジ体に局在する変異Cx26を増加させた際に、HSP70とHSP40の会合が高まるかどうかを確認する。
④ゴルジ野に局在するCxタンパクの量とヒトがんの臨床病理学的性状との関連を調べる・・・秋田大学医学部附属病院で2005年から2016年の間に摘出された肝細胞癌のホルマリン固定パラフィン包埋検体を用いて、Cx26とCx32、Cx43の免疫染色を行い、ゴルジ野に局在するCxタンパクの量と臨床病理学的性状との関連を統計学的に解析する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
Covid-19の世界的蔓延のために、購入予定だった試薬類の海外での生産が休止したことにより本年度内に支出できなかった。生産再開後に使用する予定である。
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