| 研究課題/領域番号 |
19K07500
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| 研究機関 | 順天堂大学 |
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研究代表者 |
松本 有加 順天堂大学, 医学部, 助教 (50813672)
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| 研究分担者 |
中村 哲也 順天堂大学, 医学(系)研究科(研究院), 特任教授 (70265809)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | l腸上皮傷害マウスモデル / 腸上皮治癒過程 / 腸上皮細胞脱分化 / 生体内イメージング |
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| 研究実績の概要 |
本研究の目的は、上皮障害後の治癒過程早期に出現する、創傷部を被覆する扁平な未分化細胞を生体内イメージングで追跡し、幹細胞への脱分化を惹起する特異的因子を同定することである。令和元年度においては、イメージングのための小腸上皮障害マウスモデルを確立した。このモデルを解析し、上皮傷害発生後の早期、短時間のみ出現する、目的である創傷部を被覆する扁平な未分化細胞が本モデルにおいても出現することを確認した。本年度は、この未分化細胞を選択的に採集するためのレーザーマイクロダイゼクションを行うこととした。まず、本学にあるレーザーマイクロダイゼクション機器を用いて、目的細胞の採集技術と、得られた組織片からのRNA抽出する技術の確立を行った。検体の固定方法、ダイセクション前処理工程の検討を行い、組織片から良質なRNA抽出する方法を確立した。現在、目的の未分化細胞の網羅的遺伝子発現解析にむけて、ダイゼクションで未分化細胞のみを採取し、得られたサンプルからRNA抽出する作業を行なっている。また令和元年度に引き続き、上皮創傷治癒過程を生体内イメージングで追跡するためのマウスモデルの確立を目指している。マウスの腹壁に小腸を体外から観察可能なabdominal imaging window(AIW)を装着させた状態で、一定期間、マウスを生存させる必要がある。そのため、AIWを装着する腸管・腹壁の部位、固定方法、また、AIWを装着させたマウスがAIWを脱落させることなく、健常な状態で生存する管理・飼養方法の最適化を行なっている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
マイクロダイゼクション方法の確立に時間を要した。本学で利用可能な機器は、以前、申請者らが使用していたものと異なる機器であったため、すでに確立していた操作・工程が適用可能かを検証し、最適化を行った。特に採取組織から抽出したRNAの品質の改善が必要であり、組織処理方法や処理方法などの条件検討を行った。また、一つの組織内にある目的の未分化細胞が非常に少なく、さらに一回の操作で回収できるRNAを微小であったため、網羅的遺伝子発現解析に必要な量に達するまでに時間を要している。また、COVID-19感染蔓延と、それに伴う緊急事態宣言の発令により、実験動物の購入、実験に必要な製品の確保が一部困難となり、さらに動物舎の利用が制限されたことにより、実験自体を一時中断せざるを得なくなった。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後は、レーザーマイクロダイゼクションで採集した解析対象の未分化細胞から抽出したRNAが十分量確保でき次第、マイクロアレイによる網羅的遺伝子発現解析を行ない、目的細胞のマーカーとなる遺伝子を同定する。さらにこの遺伝子に蛍光標識をした遺伝子改変マウスを作製する。並行して生体内イメージングに向けてのマウスモデルを確立させ、作製した遺伝子改変マウスをもちいた生体内イメージングを開始する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
COVID-19感染蔓延と、それに伴う緊急事態宣言の発令により、実験動物の購入、実験に必要な製品の購入が一部困難となった。また動物舎の利用制限により、実験の施行自体が減少した結果、予算の使用が少なくなった。現在、実験再開が可能な状況となっていること、要製品の発注はすでに行なっており納品待ちであることから、昨年度遅延した分の実験を早急に実施するように努め、次年度に予算を使用する予定である。
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