| 研究課題/領域番号 |
19K07504
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| 研究機関 | 滋賀医科大学 |
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研究代表者 |
石垣 宏仁 滋賀医科大学, 医学部, 助教 (90432301)
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| 研究分担者 |
伊藤 靖 滋賀医科大学, 医学部, 教授 (90324566)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | GRP94 / exocytosis / 免疫電子顕微鏡 / カニクイザル癌細胞株 / GRP94強制発現細胞株 |
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| 研究実績の概要 |
昨年度までに、癌細胞の膜上に存在する GRP78とGRP94(以下、GRPs)が結合している膜蛋白を同定するために、GRPs抗体を用いたカニクイザル癌細胞株の細胞膜の免疫沈降を行い、免疫沈降された蛋白質をLC-MS/MSを用いて分析した。またGRPsの細胞膜上への発現に、ネオセルフの機序が働いているかどうかを確かめるため、GRPsの発現量がMHCの発現量とパラレルに変化するかを確かめた。その結果、共沈蛋白のほとんどがヒートショック蛋白であり、アンカータンパクが同定できず、ネオセルフ機序に伴うGRPsの細胞表面への発現は否定的であった。 そこで、癌細胞の膜上に存在するGRPsはアンカータンパクにより細胞表面に表出するのではなく、小胞体が細胞外へ蛋白を輸送する際(exocytosis)に、小胞体の膜と細胞膜が融合することにより、細胞表面に表出するのではないかという仮説を立てた。本年度は、この仮説を証明するために、免疫電子顕微鏡を用いて、腫瘍細胞のexocytosisを観察し、細胞膜上へのGRPsの発現を確かめた。具体的には、正常線維芽細胞とカニクイザル癌細胞株を用いて、免疫電子顕微鏡を行なった。さらに抗GRP94抗体を用いてGRP94を染色し、小胞体と細胞膜におけるGRP94の局在を確かめた。
しかし電子顕微鏡による観察には成功したものの、polypclonal抗体も含めた様々なクローンの抗GRP94抗体を用いたにも関わらず、GRP94の免疫染色がうまくいかず、GRP94の局在を確かめることが出来なかった。そこでまずGRP94の強制発現細胞株を樹立し、それを免疫電子顕微鏡にて観察することとした。
現在、GRP94の強制発現細胞株を樹立しているところである。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
電子顕微鏡による観察には成功したものの、抗GRP94抗体を用いたGRP94の免疫染色がうまくいかなかったため、当初の目論見通りGRP94の局在を電子顕微鏡にて確かめることが出来なかった。対策として、GRP94の強制発現細胞株を樹立し、それを免疫電子顕微鏡にて観察することにしているが、他の方法（狭焦点レーザー顕微鏡）による代替も検討している。
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| 今後の研究の推進方策 |
引き続き免疫電子顕微鏡による観察を継続する。GRP94の強制発現細胞株を樹立を行なった上で条件検討を行い、腫瘍細胞を観察する。また並行して、狭焦点レーザー顕微鏡を用いた蛍光免疫染色により、癌細胞状のGRP94、GRP78の細胞内と細胞膜での局在を確かめる。
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