| 研究課題/領域番号 |
19K07513
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| 研究機関 | 獨協医科大学 |
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研究代表者 |
伊藤 雅彦 獨協医科大学, 医学部, 准教授 (70270486)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | 肝臓 / 肝細胞 / 毛細胆管バリア / 胆汁鬱滞 / タイトジャンクション / ZO-1 / ZO-2 |
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| 研究実績の概要 |
組織バリアの存在は多細胞生物の正常な生命活動に極めて重要であり、先天的および後天的要因によって組織バリアが障害された場合、重篤な疾患に陥る可能性がある。本研究では、組織バリアの重要な構成要素である上皮細胞間Tight Junctionに焦点を当て、その形成・維持に必須なZO family分子を組織特異的に欠損するマウスの解析を中心に、特定の臓器においてバリアが破綻した際に臓器の組織構築・生理機能・分子発現がどのように変化するか、明らかにすることを目的とするものである。
本年度は、ZO familyのZO-1およびZO-2のfloxedマウスと肝臓特異的にCreを発現するAlb-Cre トランスジェニックマウスを交配し、肝臓特異的ZO-1欠損マウスならびに肝臓特異的ZO-2欠損マウスを樹立した。ZO-2は家族性進行性胆汁鬱滞症type４(PFIC4)の責任遺伝子であることが最近報告されており、ZO-2欠損マウスは疾患モデルとなることを期待したが、PFIC4の病態に特徴的な血中AST, ALT, BA, T-bilの上昇を示さず、成長や生存の異常も認めなかった。肝臓特異的ZO-1欠損マウスについても同様であった。そこで、ZO-1とZO-2が補完的に機能している可能性を考慮し、両分子を同時に肝臓特異的に欠損させることを試みた。その結果、当該マウスは成長障害を示し、６週齢までに全個体が死亡した。また、PFIC4患者と同様の血液生化学的異常が認められたことなどから、胆汁鬱滞を発症していることが示唆された。
遺伝子異常の影響がヒトとマウスで同一ではない理由は現在まだ不明であるが、肝臓特異的ZO-1・ZO-2欠損マウスを詳しく解析することにより、肝細胞間バリアの障害がどのように肝細胞や他の細胞に影響を及ぼし臓器機能を変容させるのか明らかにし、胆汁鬱滞の治療にも貢献することを目指したい。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
研究実績の概要で述べたように、当初予想していた変化を肝臓特異的ZO-2欠損マウスが示さなかったため、肝臓特異的ZO-1欠損マウスさらには肝臓特異的ZO-1・ZO-2欠損マウスを作製することになった。これらマウスの樹立に時間を要した。
また、血管内皮特異的にCreを発現するトランスジェニックマウスをリソースセンターから購入するにあたり、学内の諸手続きに想定以上の時間が掛かり、発注以降のスケジュール全体が遅れることになった。
これらのことから、現在までの進捗状況をやや遅れているとした。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後は、樹立した肝臓特異的遺伝子欠損マウスについて詳しい解析を実施していく。まず、分子レベルでどのような変化が起きているのか、肝臓よりタンパク質およびRNAを調製してウエスタンブロッティングならびに定量PCRによって明らかにする。また、肝臓の凍結切片を作製し、細胞間接着・細胞骨格などバリアに関連する分子の局在を検討する。
加えて、肝臓のパラフィン切片を作製し、肝臓の組織構築がどのような影響を受けているか解析する。組織構築に変化を認めた場合、電子顕微鏡を用いてより微細な分析にも取り組む。さらに、京都大学との共同研究により蛍光標識物質を用いた生体ライブイメージングを行い、毛細胆管バリアの動的な機能状態を分析する予定である。これら解析によって、肝細胞に発現するZO familyの欠損を起点とする変化・異常について、分子・細胞・組織レベルで知見を得ていく。
肝臓に関する解析と並行して、入手予定のTek-Creトランスジェニックマウスを用いて血管内皮特異的遺伝子欠損マウスの樹立に取り組む。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
【理由】
当該年度は、目的の遺伝子変異マウスを樹立するための交配が主となったこと、その他解析に使用した試薬類の多くが汎用性の高いものであり、前年度までに購入したものが継続して利用可能であったために、新たに購入する試薬類が当初の予定よりも減少したことなどが、次年度使用額の生じた理由である。
【使用計画】
まず、分子レベルの解析に必要な試薬類に使用する計画である。具体的には、ウエスタンブロット解析・免疫染色解析に用いる抗体や試薬、定量PCR解析に用いるプライマーや試薬類の購入に使用する。さらに、生体ライブイメージングの実施に掛かる費用に使用する。また、解析に用いる肝臓特異的遺伝子欠損マウスを継続的に維持するための飼育費用、血管内皮特異的遺伝子欠損マウスの樹立に必要なマウス飼育費用にも使用する。十分なデータを得ることができれば、学会発表や論文発表のためにも使用したいと考えている。
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