| 研究課題/領域番号 |
19K07549
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| 研究機関 | 崇城大学 |
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研究代表者 |
下野 和実 崇城大学, 薬学部, 教授 (30415187)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | トランスポーター / エントロピー / 多剤認識 / 疎水性相互作用 / 合理的医薬品設計 |
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| 研究実績の概要 |
本研究は，EmrEをモデルとして病原菌の多剤耐性化の一因である多剤排出トランスポーターが認識する多様な薬物との結合力の強弱を生み出す分子機構を熱力学的に解釈し，新規阻害薬創成へと応用することを目的とする。本年度は，以下の３つのことを明らかにした。
1）荷電性アミノ酸変異体EmrEを用いた熱力学測定の結果から，Asp84の荷電状態によって基質結合駆動エネルギーが転換すること，Glu25とAsp84の荷電状態の変化が基質輸送サイクルを駆動していることを明らかにした。また，報告されている予測立体構造モデルを考慮すると，Asp84はHis110との静電相互作用が，基質輸送サイクルにおけるEmrEの立体構造変化を制御している可能性がある。
2）EmrEの基質結合におけるエントロピー効果のメカニズムを解明するために，水分子の寄与と構造柔軟性を比熱容量とエンタルピーエントロピー補償解析，種々の基質誘導体の熱力学測定を行なった。その結果，基質結合におけるアルカリ性条件下での大きなエントロピー効果は，EmrE分子内部の水分子の放出による脱水和エントロピーが主要因であることを明らかにした。
3）分子動力学法によるEmrE分子内部の水分子の動的解析を行った。基質結合に伴い排除される水分子の運動性を解析したところ，運動性が低く強固に結合している水分子が２個見出した。２個の水分子は，水分子が排除される際のエントロピー利得が大きく，さらに基質結合やプロトン輸送に重要であるGlu14と水素結合している。疎水性相互作用は，基質の種類に比較的依存しないと考えられるため，Glu14と水素結合した２個の水分子が，多剤認識に重要な役割を果たしていると推察される。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究は，多剤排出トランスポーターが認識する多様な薬物との結合力の強弱を生み出す分子機構を熱力学的に解釈するために，EmrEと多くの基質結合の熱力学特性を明らかにすることを目的としている。補助事業期間中にはEmrEと多くの基質との結合熱力学量を比較解析することで，EmrEの基質結合の熱力学特性を明らかにする。さらに，計算化学的手法により，水分子排除および静電相互作用によるエネルギー利得を見積もり，定量的に結合エネルギーの寄与を明らかにする。
本年度は，変異体解析とpHを考慮したエンタルピーエントロピー補償解析により，pHにより結合様式が転換する機構はAsp84を介した静電相互作用による立体構造変化およびEmrE分子内部から排除される水分子の数の違いであることを明らかにし，EmrEと基質との結合の熱力学特性の基礎となる知見を得た。本年度は，主に一種類の基質を中心に解析した。これは，熱力学パラメータの解釈には，詳細なエンタルピーエントロピー補償の分子論的解釈や比熱容量の解釈が必要であると考え，この解析に時間を費やしたためである。また，in silicoでの多剤結合解析を可能とするために，ドッキングシミュレーション方法の適用や水分子の動的解析のための分子動力学計算を主に行ったためである。
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| 今後の研究の推進方策 |
エンタルピーエントロピー補償解析で求めたパラメタータについては，直線のグラフの傾きは構造柔軟性，切片は脱水和エントロピーであるとされる。この理論によるとギブズエネルギーとエンタルピーの関係も直線関係になるはずである。本年度の解析について，pHは考慮したものの，ギブズエネルギーとの関係は考慮していないので，今後ギブズエネルギーを含めた構造柔軟性，脱水和エントロピー，結合エネルギー変換pKaを算出し，より正確な結合パラメータから，熱力学特性を考慮したEmrEの基質結合メカニズムを明らかにしていく。さらに変異体や多種類の基質の熱力学情報と，コンピューターシミュレーションによる結合親和性の大規模スクリーニングから定量的に結合エネルギーの寄与を明らかにして新規阻害薬創成につながる知見を得る。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本年度は、旅費として計上していた日本薬学会が中止となり次年度使用額が生じた。次年度では、多種類の基質購入費用や界面活性剤、無細胞タンパク質合成キットの購入に使用する予定である。
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