| 研究課題/領域番号 |
19K07555
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
戸邉 亨 大阪大学, 医学系研究科, 教授 (70207596)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | 病原性 / 腸管出血性大腸菌 / 発現抑制 / 増殖抑制 / RNase |
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| 研究実績の概要 |
腸管出血性大腸菌EHEC O157 Sakai株が保有するType II Toxin-Antitoxin (TA) systems のうち、主に非病原性大腸菌K-12株にはないECs5400-5399について解析を進めた。toxin遺伝子ECs5400を強制的に発現誘導した菌における転写量の変化をRNA-seqを用いて検討したところ、LEE4, LEE5オペロンの転写量が低下していた。さらに、複数のストレス関連遺伝子の転写量の低下も認められた。一方、本来のTA活性化と類似の状態を観察するために、dCas9を用いたCRISPRi系を用いて染色体上のantitoxin遺伝子のみの発現抑制を誘導できる菌株を作成した。この菌において、antitoxin遺伝子発現を抑制すると、増殖に対する影響は認められなかったが、病原性遺伝子および細胞付着能の低下が観察された。この結果は、TA systemの役割が、菌の増殖抑制ではなく選択的遺伝子発現抑制である我々の仮説を指示するものである。ECs5400の発現誘導でストレス関連遺伝子への影響が認められたことから、ストレス感受性への影響を検討した。その結果、CRISPRiの系を導入した菌でantitoxin遺伝子の発現を抑制したところ酸化ストレスに対する耐性が上昇していた。また、ECs5400-5399オペロンのプロモーター活性も酸化条件下で上昇していた。このことは、ECs5400-5399 TA systemが酸化ストレスとの関連性を示唆している。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
当初の計画であった、RNA-seq解析を進め、選択的な転写抑制が確認できた。また、強制発現系ではなくより自然な活性化による変化に近い観察ができる染色体上の遺伝子の操作により活性化できる系を作成し、TA system活性化による選択的抑制を確認できた。しかし、RNA-seqのデータからはRNaseのチョ臆説的な標的遺伝子および切断配列を同定することは困難であったため、新たにTA system活性化直後の転写をRNA-seqにより解析する必要がある。また、TA systemの活性化についても酸化ストレスである可能性が強く示唆されたが、確定するためには詳細に解析する必要がある。
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| 今後の研究の推進方策 |
TA system 活性化直後のRNA-seq解析を行い、RNase Toxinの直接の標的遺伝子および標的配列の同定を試みる。また、酸化ストレスに応答する可能性が高いことから、実際のストレスが誘導される条件について検討を進め、生存および適応における具体的な機能を明らかにする。これらを論文としてまとめ発表する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
当初の計画より解析が遅れており、実験の追加および論文投稿などの発表に経費が必要となったため。
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