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2019 年度 実施状況報告書

新たな百日咳ワクチンの開発に向けて-外膜ベシクルと宿主細胞の相互作用

研究課題

研究課題/領域番号 19K07561
研究機関杏林大学

研究代表者

花輪 智子  杏林大学, 医学部, 教授 (80255405)

研究分担者 阿部 章夫  北里大学, 感染制御科学府, 教授 (50184205)
桑江 朝臣  北里大学, 感染制御科学府, 准教授 (60337996)
研究期間 (年度) 2019-04-01 – 2022-03-31
キーワード百日咳菌 / ベシクル / OMV / ワクチン
研究実績の概要

百日咳は百日咳菌による急性気道感染症であり、日本を含む先進国では予防のため無細胞ワクチンの接種が行われている。しかし現行のワクチンは発症を抑制しても感染を防御できず、国内の患者報告数は年間1万人を超えていることから新規ワクチンの開発が望まれている。
外膜ベシクル(OMV: outer membrane vesicle)は細菌由来のタンパク質、DNAなどが外膜成分により包まれた直径30-250 nmの小胞であり、グラム陰性菌により分泌される。病原細菌の分泌するOMVにはしばしば病原因子が含まれており、病原性発現に関わっていると考えられている。百日咳においてもOMVをワクチンに用いるための研究が行われているが、これらは超音波処理により放出されるものであり細菌独自の機構により分泌されるものではない。そこで様々な由来のOMVに含まれるタンパク質を解析し、百日咳菌の病原性発現におけるOMVの病原性における役割を検討する。宿主内において細菌のおかれている環境は多様であり、それぞれの環境因子に応答して病原性の発現を調節していると考えられている。本課題では、百日咳菌が宿主内微小環境に応答して種々のOMVを分泌しそれらが異なる役割を担うことで病原性を制御しているという仮説の下、細胞表層ストレス応答およびペリクルに由来するOMVの特徴および宿主細胞との相互作用を解析する。本研究の成果は、百日咳菌の定着や病原性発現の制御機構を理解に繋がり新規ワクチン開発の端緒となる。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

百日咳菌のペリクル由来OMVは振とう培養した菌由来のOMVと含有タンパク質の種類および密度が異なる。そこでそれぞれのOMVの性状を詳細に解析している。
百日咳菌の臨床分離株およびワクチン株の培養液を遠心分離、ろ過して細菌細胞を除去し、超遠心分離またはExoBacteria OMV isolation Kit (System Biosciences 社製)を用いてOMVを調製した。それを用いてSDS-PAGEにより解析した結果、タンパク質のプロファイルに一部違いがみられたため、主要なバンドについて解析を進めている。
細胞表層ストレス応答はRNAポリメラーゼσサブユニットであるRpoEが担うため、anit-RpoEであるRseAを欠損させるとRpoEは常に活性化する。このrseA変異株を振とう培養し、細胞表層ストレス由来のOMVを調製した。変異株に含まれるOMVのタンパク質は親株と顕著な違いがみられなかったが、その産生量が多い傾向が認められた。一方、OMVの密度はOptiPrepを用いた密度勾配遠心法、粒子径はゼータサイザーにより測定した結果、バイオフィルム由来のOMVの粒子径は、浮遊菌由来のものより大きい傾向がみられた。含有タンパク質の解析では、OMVに含まれるタンパク質をSDS-PAGEおよびイムノブロッティング解析したところ、そのパターンに違いがみとめられたため、プロテオーム解析を行った。その結果、補体不活化因子であるVag8、BrkAなどはいずれのOMVにも含まれていたが、赤血球凝集素、アデニレートシクラーゼ毒素など定着に関わる病原因子がバイオフィルム由来のOMV有意に多く含まれていた。一方、浮遊菌由来のOMVにはバイオフィルム由来OMVより多種のタンパク質が含まれていた。現在含まれていた病原因子の生物活性などを調べている。

今後の研究の推進方策

これまで明らかとなったバイオフィルム由来OMVに含まれる定着に関わる病原因子の生物活性および局在を明らかにし、百日咳菌病原性発現における役割を推察する。また、OMVに含まれる病原因子の活性を測定する。さらに各病原因子に対する抗体を用いて蛍光顕微鏡または免疫電子顕微鏡により局在を解析する。これらの方法により検出が困難な場合、病原因子タンパク質とGFPの融合タンパク質を用いる方法も検討する。
また、OMVとマクロファージおよび上皮細胞との相互作用を検討し、百日咳菌の病原性におけるOMVの役割を明らかにする。ヒト肺胞上皮細胞株A549またはJ774.1などのマクロファージ細胞株に、蛍光標識したOMVを添加し、形態の変化、培養上清中の産生されるIL-1b、IL-6、IL-8などのサイトカイン産生量および菌の付着能や貪食能を測定する。また、OMVの細胞への取り込みを蛍光顕微鏡により観察し、OMVと細胞の相互作用を明らかにする。

次年度使用額が生じた理由

研究の効率化を鑑みて行う実験の順序を入れ換え、2020年度に組み込むこととしたことで、それにかかる試薬の金額に差がでたため。

  • 研究成果

    (7件)

すべて 2020 2019

すべて 雑誌論文 (3件) (うち国際共著 1件、 査読あり 3件、 オープンアクセス 3件) 学会発表 (4件) (うち国際学会 1件、 招待講演 1件)

  • [雑誌論文] Skin and Soft Tissue Infections Caused by Different Genotypes of PVL-Positive Community-Acquired Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus Strains.2020

    • 著者名/発表者名
      Hanawa T, Shimoda-Komatsu Y, Araki K, Ohyama M, Ohnishi H, Kamiya S, Matsuda T.
    • 雑誌名

      Jpn J Infect Dis.

      巻: 73 ページ: 72-75

    • DOI

      doi: 10.7883/yoken.JJID.2019.162.

    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] Enhanced infectivity of strains of Helicobacter pylori isolated from children compared with parental strains.2019

    • 著者名/発表者名
      Zaman C, Osaki T, Furuta Y, Hojo F, Yonezawa H, Konno M, Kurata S, Hanawa T, Kamiya S.
    • 雑誌名

      J Med Microbiol.

      巻: 103 ページ: 7781-7765

    • DOI

      doi: 10.1099/jmm.0.000918.

    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] Silviavirus phage phiMR003 displays a broad host range against methicillin-resistant Staphylococcus aureus of human origin.2019

    • 著者名/発表者名
      Peng C, Hanawa T, Azam AH, LeBlanc C, Ung P, Matsuda T, Onishi H, Miyanaga K, Tanji Y.
    • 雑誌名

      Appl Microbiol Biotechnol.

      巻: 103 ページ: 7751-7765

    • DOI

      doi: 10.1007/s00253-019-10039-2.

    • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
  • [学会発表] ファージ療法の実現に向けた治療効果の基礎的検討 - ヒト臨床試験の検証から -2020

    • 著者名/発表者名
      花輪智子、松田剛明
    • 学会等名
      第93回日本細菌学会総会
    • 招待講演
  • [学会発表] 百日咳菌の外膜ベシクルに含まれる病原因子の解析2019

    • 著者名/発表者名
      花輪智子、蒲地 一成、米澤 英雄、蔵田 訓、大崎 敬子、北条 史、神谷茂
    • 学会等名
      第92回日本細菌学会総会
  • [学会発表] (p)ppGpp欠損変異によるHelicobacter pylori の性状の変化2019

    • 著者名/発表者名
      宮岡千尋、花輪智子、北条史、河野洋平、米澤英雄、大崎敬子、蔵田訓、川上速人、青山隆夫、神谷茂
    • 学会等名
      第33回日本バイオフィルム学会学術集会
  • [学会発表] Efficacy of Novel MRSA phage Treatment in Murine Wound Infection Model2019

    • 著者名/発表者名
      T. Hanawa, K. Miyanaga, F. Hojo, N. Ohura, H. Ohnishi, S. Kamiya, Y. Tanji, T. Matsuda
    • 学会等名
      ASM Microbe 2019
    • 国際学会

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公開日: 2021-01-27  

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