| 研究課題/領域番号 |
19K07572
|
|---|
| 研究機関 | 国立感染症研究所 |
|---|
研究代表者 |
大塚 菜緒 国立感染症研究所, 細菌第二部, 主任研究官 (90596610)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
|
| キーワード | Bordetella pertussis / fimbriae / gene expression / RisA |
|---|
| 研究実績の概要 |
百日咳菌の線毛遺伝子fim3は複雑な発現制御機構下に置かれており、Pfim3 poly(C) ≧14Cの場合には vag(virulence-associated gene)として、≦13Cの場合にはvrg (virulence-repressed gene)として機能することが判明した。そこで、fim3がvrgとして機能するにはリプレッサーBvgR, アクチベーターRisAの制御を受けることが示唆された。
R1年度に百日咳菌RisAのPfim3への結合解析を行ったところ、精製RisAの構造に可溶化剤が影響を与えている可能性およびRisAの結合に他の因子の関与（RisAのリン酸化やc-di-GMPの存在）している可能性が示唆された。そこでR2年度は本研究で必要となるタンパク質およびプラスミドの調製、遺伝子破壊株の作製を行った。まず、6His-RisAの可溶化剤不含条件での精製を検討したところ、尿素を加えなくともある程度塩濃度を上げることでタンパク質の凝集・析出を防ぐことが可能であることが分かった。また、リン酸化の影響を検討するために、組換え変異型RisA(リン酸化低減D60E, リン酸化欠損D60N)を産生する大腸菌を作出した。次に、百日咳菌内でRisAをリン酸化するkinase酵素としてRisKが考えられたため、大腸菌における組換えRisKの調製を試みた。ところが、His-tag位置、大腸菌株、risK配列の大腸菌への最適化等を検討したが、いずれもRisKの産生量を改善するに至らなかった。一方、risA遺伝子の存在／非存在下でのfim3プロモーター活性を測定する目的で、百日咳菌risA遺伝子欠損株およびレポータープラスミドを作製した。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
R2年度は本研究を推進する上で必要な可溶化剤不含条件でのRisAタンパク質精製、遺伝子破壊株作製、レポータープラスミド作製等を行うことができたため、おおむね順調に進展している。
|
| 今後の研究の推進方策 |
リン酸化酵素RisKの組換え体を十分量得ることが難しいと判断されたため、リン酸化はアセチルリン酸リチウムカリウムをリン酸基ドナーとして用いる化学的な方法で行うこととした。R3年度はR2年度に作製した道具（組換えタンパク質、菌株、プラスミド）を用いて、解析を進める予定である。
|
| 次年度使用額が生じた理由 |
新型コロナ感染症の国内感染状況に伴い、出張を伴う学会参加費への支出がなくなったため。次年度以降の試薬購入や論文掲載料に充てる予定である。
|
