| 研究課題/領域番号 |
19K07572
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| 研究機関 | 国立感染症研究所 |
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研究代表者 |
大塚 菜緒 国立感染症研究所, 細菌第二部, 主任研究官 (90596610)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | Bordetella pertussis / fimbriae / RisA |
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| 研究実績の概要 |
百日咳菌の線毛遺伝子fim3は複雑な発現制御機構下に置かれている。fim3遺伝子の上流(Pfim3領域)には特徴的なpolyC配列が存在するが、我々はこれまでにPfim3 polyC ≧14Cの場合はfim3遺伝子がvag (virulence-associated gene)、≦13Cの場合はvrg (virulence-repressed gene)として機能することを明らかにした。さらにfim3がvrgとして機能するにはリプレッサーBvgRおよびアクチベーターRisAの制御を受けることが示唆された。本研究は、fim3発現におけるRisAの制御機構を明らかにすることを目的とする。
まず、組換えRisAタンパク質の精製方法を検討した。当初は組換えRisAの可溶化のため尿素含有の条件で精製していたが、尿素の存在によりRisAが本来とは異なる構造をとっている可能性が指摘された。そこで、可溶化剤不含有条件でのタンパク質精製を行なった。次に、得られた組換えRisAを用いた結合解析により、RisAが特異的にPfim3 poly-13Cに結合することを明らかにした。ただし、これまでの遺伝子発現解析により、RisAがアクチベーターとして機能する際にリン酸化およびc-di-GMPの関与が示唆されており、これら因子の存在によりRisAのPfim3-DNAへの結合が促進されることが予想された。そのため、次にRisAのリン酸化および検出条件の検討を行った。20 mMアセチルリン酸リチウムカリウム（リン酸基供与体）でRisAを処理すると、Phos-tag SDS-PAGEによりリン酸化されたRisA（RisA~P）が検出された。一方、RisA変異体ではリン酸化によるバンドのシフトアップは認められなかった。c-di-GMPはRisAのリン酸化に影響を与えなかったことから、c-di-GMPはRisA-PがPfim3へ結合する際に関与するものと考察された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
in vitro RisAリン酸化の処理条件および検出方法に検討を要したため。
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| 今後の研究の推進方策 |
RisAのPfim3-DNAへの結合をRisA-Pおよびc-di-GMPが促進するか結合解析により明らかにする。また、野生株およびrisA欠損変異株でPfim3-13C/Pfim3-14Cのプロモーター活性を測定する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
研究計画の遅れにより次年度使用が生じた。当初、令和4年度までに計画していた研究項目を令和5年度に実施する予定である。
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