| 研究課題/領域番号 |
19K07572
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| 研究機関 | 国立感染症研究所 |
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研究代表者 |
大塚 菜緒 国立感染症研究所, 細菌第二部, 主任研究官 (90596610)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2025-03-31
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| キーワード | Bordetella perturssis / fimbriae / RisA |
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| 研究実績の概要 |
百日咳菌の線毛遺伝子fim3の上流(Pfim3領域)には特徴的なpolyC配列が存在するが、我々はこれまでにPfim3 polyC ≧14Cの場合はfim3遺伝子がvag (virulence-associated gene)、≦13Cの場合はvrg (virulence-repressed gene)として機能することを明らかにした。さらにfim3がvrgとして機能するにはアクチベーターRisAの制御を受けることが示唆されたため、本研究ではfim3発現におけるRisAの制御機構を明らかにすることを目的とする。
まず、組換えRisAタンパク質の精製方法を検討し、可溶化剤不含有条件でのタンパク質精製を行なった。組換えRisAを用いてゲルシフトアッセイ(EMSA)を行ったところ、RisAが標的配列Pfim3 poly-13C(200 bp)に特異的に結合することを明らかにした。ただし、これまでの遺伝子発現解析により、RisAがアクチベーターとして機能する際にリン酸化およびc-di-GMPの関与が示唆されており、これら因子の存在によりRisAのPfim3-DNAへの結合が促進されることが予想された。20 mMアセチルリン酸リチウムカリウム（AcP）でRisAWTを処理したところ、Phos-tag SDS-PAGEによりリン酸化されたRisA（RisA~P）が検出された。一方、RisA変異体(D60E, D60N)ではリン酸化によるバンドのシフトアップは認められず、RisAはD60にリン酸化を受けることが確認された。RisAはc-di-GMP単独存在下ではPfim3への結合がほぼ認められなかったが、RisA~Pではやや結合が促進され、さらにリン酸化された状態でc-di-GMPが存在した場合にはDNAへの結合が大きく促進されることが明らかになった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
in vitro RisAリン酸化の処理条件および検出方法に検討を要したため。
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| 今後の研究の推進方策 |
RisAのPfim3-13CまたはPfim3-14Cへの結合をRisA-Pおよびc-di-GMPが存在する条件で結合解析を行いKd値を比較する。また、野生株および∆risA株でPfim3-13C/Pfim3-14Cのプロモーター活性をbeta-galactosidaseアッセイにより測定する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
研究計画の遅れにより次年度使用が生じた。当初、令和5年度までに計画していた研究項目を令和6年度に実施する予定である。
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