研究課題
我々はこれまでにインフルエンザウイルスのリボヌクレオタンパク質（vRNP）を用いたin vitro RNA合成実験により、vRNPがループ状の二本鎖RNAを合成することを発見した。しかし、インフルエンザウイルスの場合、感染細胞において二本鎖RNAが検出されないことから、インフルエンザウイルスは二本鎖RNAをマスクする機構を備えており、それにより自然免疫応答から逃れていると考えられる。そこで本研究では、二本鎖RNA結合能を持つインフルエンザウイルスタンパク質NS1に着目し、インフルエンザウイルスの二本鎖RNAのマスキング機構を解明することを目的とする。本年度はまず、NS1欠損ウイルス感染細胞内で二本鎖RNAがマスクされることなく検出されるかどうか確認した。免疫蛍光染色の結果、野生型ウイルス感染細胞では二本鎖RNAはほとんど検出されなかったのに対し、NS1欠損ウイルス感染細胞で二本鎖RNAの強いシグナルが検出された。さらに興味深いことに、二本鎖RNAはおよそ感染8時間後から核において検出されるが、時間が経つにつれて細胞質でも検出されることが分かった。以上の結果から、NS1が二本鎖RNAのマスキングに関与していること、さらに核から細胞質へ放出された二本鎖RNAが細胞質に存在するRNAセンサーによって認識され自然免疫を誘導する可能性が示唆された。さらに組み換えNS1変異体を作製し、二本鎖RNAのマスキングに重要なアミノ酸の同定を試みた。高速原子間力顕微鏡による観察の結果、二本鎖RNAの結合に重要なN末端側のアミノ酸は二本鎖RNAのマスキングには重要ではなく、二本鎖RNA結合には関与しないC末端側のアミノ酸が二本鎖RNAのマスキングに重要であることが明らかとなった。以上の結果は、NS1のC末端側の相互作用を介した会合体形成により、二本鎖RNAがマスキングされる可能性を示唆している。
1: 当初の計画以上に進展している
インフルエンザウイルスの場合、ゲノムの転写および複製は核内で行われることから、たとえ核内でvRNPによる二本鎖RNAの形成が起きたとしても、細胞質に存在するRNAセンサーによっては認識されないことから自然免疫も引き起こさないと予想された。しかし、本年度の研究成果から核内で形成された二本鎖RNAは細胞質へと放出されることが明らかとなり、この二本鎖RNAによって自然免疫を引き起こす可能性が強く示唆された。さらに、NS1の二本鎖RNAのマスキングに重要なアミノ酸に関しても、当初予想していたN末端のRNA結合ドメインではなく、C末端側のドメインが重要であることを明らかとした。以上のことから、これまでにない新しい知見が次々と得られており、当初の計画以上に進展していると判断した。
昨年度同定した二本鎖RNAのマスキングに重要なNS1のアミノ酸について、その変異ウイルスをリバースジェネティクス法により作出する。次に、得られた変異ウイルスを感染させた細胞において二本鎖RNAが検出されるかどうかを免疫蛍光染色法により解析し、NS1欠損ウイルスとの比較検討を行う。また当年度は、NS1の二本鎖RNAに対する結合様式の解析を高速原子間力顕微鏡を用いて行う。予備検討の結果、NS1の二本鎖RNAへの結合はウイルスvRNP由来のループ状の二本鎖RNAとpoly(I:C)などの人工合成二本鎖RNAとで異なっており、前者に対してはRNA全体を覆うような形で結合するのに対して、後者に対してはまばらに結合することが確認されている。この違いが何によるものかを高速原子間力顕微鏡観察により解明したい。さらに、NS1のウイルス二本鎖RNAへの結合を高速原子間力顕微鏡を用いたリアルタイムイメージングにより解析する。マスキングの過程を追うことにより、NS1の二本鎖RNAへの結合がランダムなものかあるいは規則的なNS1間相互作用によるものかを解明したいと考えている。
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