| 研究課題/領域番号 |
19K07580
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| 研究機関 | 藤田医科大学 |
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研究代表者 |
村田 貴之 藤田医科大学, 医学部, 教授 (30470165)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | EBV / プライマリーB細胞 / 潜伏感染 / 溶解感染 / テグメメント |
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| 研究実績の概要 |
これまでEBVの感染の研究は主に、ウイルスを細胞株に感染することで観察されてきた。細胞株の扱いは比較的容易であり、クローナルな細胞なので再現性もとりやすいというメリットがあるが、一方で細胞株は不死化、がん化している細胞のモノトーナスな集団であるので、必ずしも実際のヒト体内での感染を反映していない可能性がある。そこで本研究では、ヒトのプライマリーB細胞を実験に使用することとした。これによって、より自然な状況でEBウイルス感染の様子を観察できる。
研究は順調に推移している。
まず、Akataウイルス感染AGS細胞から、高いタイターの野生型EBVウイルス液を調製することに成功した。プライマリーB細胞は、健常人ドナーの末梢血単核球からMACSでソーティングしたものを用意した。上記ウイルスを十分高いMOI（multiplicity of infection）でプライマリーB細胞に感染し、経時的にRNAを回収し、RNA-seqを行った。この結果、ウイルス遺伝子や細胞遺伝子の発現について、これまでに知られていない、非常に興味深い発見があった。なお、ドナーや条件のブレを考慮し、同じような感染実験を２度行ったが、ほぼ同様の結果が得られている。
次に、同様に野生型EBVウイルスを健常人ドナー由来プライマリーB細胞に感染させ、時間を追って回収し、電子顕微鏡や蛍光抗体法による形態学的な観察を行った。すると、これまでに報告がない、ある細胞小器官の質的な変化が発見された。この質的変化をもたらすことが知られているある宿主遺伝子の発現が、ウイルス感染によって増強していることも、RNA-seqの結果から明らかになった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
野生型EBVウイルスを健常人ドナー由来プライマリーB細胞に感染させる、という、より自然な感染に近い、適切な条件での感染実験を行い、多面的、包括的な解析を行うことによって、新たに大きな２つの知見を得た。すなわち、ウイルス感染後のウイルス遺伝子、宿主遺伝子の経時的変化パターンと、感染による、ある細胞小器官の質的変化である。
なお、年度当初、次世代シークエンサーが壊れてしまっており、なかなか修理できなかったため、データが得られない期間があったが、現在では修理され、結果も得ることができている。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後も、野生型EBVウイルスを健常人ドナー由来プライマリーB細胞に感染させる、という系を使って、感染に伴う変化の解析を行っていきたい。さらに、この細胞小器官の質的変化を阻害する薬剤があるので、これを用いて、その小器官の変化が抑制されるかどうか、また、不死化効率に影響を及ぼすかどうか、確認していきたい。
また、ウイルス遺伝子、宿主遺伝子発現パターンの変化をもたらし得る、ウイルス側の責任遺伝子の同定も試みるものとする。すなわち、遺伝子発現を変化させると推測されるいくつかのウイルス遺伝子の欠損ウイルス株を作成し、それらをプライマリーB細胞に感染させて、野生株ウイルス感染で生じた変化と比較することで、実際に遺伝子発現変化をもたらしているウイルス遺伝子を同定する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本年度当初、次世代シークエンサーが故障し、一時研究が滞った時期があった。その後機械は修理され、研究は十分進展したが、一部年度内に使い切れない金額が生じた。次年度はこの故障期間の分を取り戻すべくさらに実験に励む予定であり、残額も次年度に使用し切る予定である。
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