| 研究課題/領域番号 |
19K07601
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| 研究機関 | 公益財団法人東京都医学総合研究所 |
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研究代表者 |
小林 郷介 公益財団法人東京都医学総合研究所, 疾患制御研究分野, 主席研究員 (80644989)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | エンテロウイルス７１ / 受容体 / 組織特異性 / 宿主因子 |
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| 研究実績の概要 |
Enterovirus 71 (EV71)は手足口病の病原体であるが、諸外国において中枢神経合併症が公衆衛生上の大きな問題となっている。EV71の感染個体内における組織指向性が、組織特異的に発現している宿主因子とEV71との相互作用に起因するという仮説に基づいて、EV71の標的組織における増殖性をモデル細胞株を用いて評価し、ゲノムワイドノックアウトライブラリースクリーニングによってEV71の増殖に必要な宿主因子を同定し、その中から組織特異的な因子を発見することを最終目標としている。
昨年度までに、EV71の病原性と最も密接している神経細胞に焦点を絞って解析したところ、神経芽細胞腫SH-SY5Y細胞がEV71の病原性に重要な宿主因子を発現している可能性が明らかになった。
今年度は、SH-SY5Y細胞におけるEV71の感染に重要な宿主因子の同定を行った。これまでの経験からEV71を用いてGenome-wide CRISPR-Cas9 knockout (GeCKO)Screeningを行うと、受容体であるSCARB2以外の因子が取れないことがわかっていた。そこで、GeCKOに含まれるsgRNAに認識されない変異型SCARB2を作製し、SH-SY5Y細胞に強制発現させた細胞を作った。この細胞で複数のEV71株を用いてGeCKO screeningを行った。その結果、これまでに報告されていない複数の宿主因子が、複数株で共通して同定された。それらの因子のうちのいくつかは、細胞表面に発現する膜貫通型のタンパク質をコードしていた。現在、これらの遺伝子のノックアウト細胞の樹立と、これらの遺伝子をクローニングして強制発現細胞を作製中である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
研究計画のコアとなるSH-SY5Y細胞を用いた宿主因子のスクリーニングによって、複数の宿主因子を得た。これらは複数株のスクリーニングによって再現性が確認されており有望である。プレリミナリーな因子のバリデーション実験において、いくつかの因子をノックアウトした細胞はEV71の感染に抵抗性を示しており、期待が持てる。これらの因子の詳細な解析を行わない限り断言はできないが、本研究計画で目指した、「EV71の組織指向性を規定する宿主因子」がこれらの中に含まれる可能性は高く、研究は順調であると考える。
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| 今後の研究の推進方策 |
今回同定した因子のノックアウト細胞と過剰発現細胞を作製し、EV71感染における重要性を評価する。重要性が確認された因子については、その因子がEV71の感染・複製過程のどこで働いているかを調べる。
研究代表者の研究室ではEV71の感染動物モデル「hSCARB2-tgマウス」を開発した。これは、EV71の受容体ヒトSCARB2遺伝子を導入したマウスで、EV71に感染すると中枢神経系に感染して麻痺などの症状を示す。このマウスにおいてはSCARB2以外の宿主因子がマウス型であってもEV71が増殖可能であることを示している。もしそうであれば、今回同定した因子はマウス型であっても機能するはずである。これを確認するために、今回同定した因子のマウスのホモログをクローニングして強制発現しヒト型と比較する。
また、ヒトおよびhSCARB2-tgマウス体内での発現分布を免疫組織化学染色等で調べたり、同定した因子のノックアウトマウスを作製して、EV71感染個体における機能を調べる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
参加予定だった、国際学会および国内学会が中止になり旅費や参加費として使用予定だった分が余った。次年度も学会開催は不透明な部分が多いが、旅費の分を消耗品として執行する予定である。
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