RNF43によるWnt受容体ユビキチン化の分子メカニズムの解明と治療への応用

2019 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 19K07633
• 研究機関: 北海道大学
• 研究代表者: 築山 忠維 北海道大学, 医学研究院, 助教 (20399819)
• 研究期間 (年度): 2019-04-01 – 2022-03-31
• キーワード: Wnt / multistep tumorigenesis / crosstalk / Ras / FGF

研究実績の概要

幹細胞特異的ユビキチンリガーゼであるRNF43はp53経路を抑制すること、Wnt受容体のFzdを分解すること、がん抑制遺伝子として機能していること、その遺伝子変異によってがん遺伝子へと転換することを報告してきた。しかしRNF43は比較的最近発見された分子であり、その機能にはまだ不明な点が多い。本研究では、①RNF43がp53経路を抑制する分子メカニズムの解明、②リン酸化スイッチによるRNF43機能調節の分子メカニズムを解明、③FGFシグナルとWntシグナルのクロストークによる恒常性維持メカニズムの解明、を目的としている。
令和元年度終了までに得られた結果として、②のRNF43のリン酸化スイッチによるWntシグナル調節機能についての研究成果は国際総合誌に投稿中であり、現在は修正投稿中である。③については、現在までにFGFがWntシグナルを増強することを確認した。また各種阻害剤を用いた解析の結果、FGFによるWntシグナル増強にはFGF-PI3K-Akt経路は関与しないこと、一方でFGF-Ras-MAPK経路が必須であることを明らかにした。さらにFGF刺激はこれまでの報告とは異なり、Wntシグナルのエフェクター分子であるβ-cateninの蓄積を誘導しないこと、しかしFGFによる増強にβ-catenin-Tcf/Lef複合体の形成は必要であることが確認された。そこで現在はこれらの結果をもとに、FGF刺激が核内でβ-cateninに結合するタンパク質の複合体形成に影響する可能性を検討した。その結果、FGF刺激によって核内でβ-cateninへの結合が変化するタンパク質を複数同定した。現在は質量分析器を用いてこれらの候補タンパク質の解析を行っている。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

現在までに、当初からの研究計画通り様々な阻害剤を組み合わせてFGFの下流でWntシグナルを促進する分子経路を同定することが出来た。またその際に、細胞内でエフェクター分子であるβ-cateninが蓄積するというこれまでのモデルは否定され、FGF刺激により核内複合体に変化が起こることで転写活性が上昇するというモデルを提示することが出来た。さらにFGF刺激により核内で惹起されるタンパク質結合の変化も観察出来たので、本研究計画の導入部は順調に進展していると考えられる。

今後の研究の推進方策

現在は、質量分析器を用いてFGF刺激により結合に変化が起こる核内タンパク質の同定を行っている。結合タンパク質が同定された際には、FGFによる結合様式の変化の分子メカニズムを免疫沈降を用いて確認し、その後は次世代シークエンスによるRNAシークエンスやクロマチンIP-シークエンシングを用いて、FGF刺激による核内複合体の変化がWnt標的遺伝子発現の変化に及ぼす影響を全ゲノム的に解析する。さらにFGFによるWntシグナルの増強が発がん過程に及ぼす影響を、ゼブラフィッシュやマウスオルガノイド、さらに発がんモデルマウスを用いて検討する予定である。
しかし、昨今のコロナウィルスによる非常事態宣言により、他大学との共同研究による質量分析器によるタンパク質同定サービスに大きな遅延が出ているため、今後の研究の進展に影響を及ぼす可能性も否定できない。

次年度使用額が生じた理由

当初は令和元年度に投稿中の論文が受理されることを想定し、約65万円の論文投稿料の支払いを予定していた。しかし論文の審査が予定以上に長引き受理が令和
２年度以降へずれ込んだため、それにともなって論文投稿料分が翌年度へと持ち越された。

研究成果

• [国際共同研究] IMBA(オーストリア)
  • 国名: オーストリア
  • 外国機関名: IMBA
• [国際共同研究] ケンブリッジ大学(英国)
  • 国名: 英国
  • 外国機関名: ケンブリッジ大学
• [雑誌論文] The role of Mediator and Little Elongation Complex in transcription termination (2020)
  • 著者名/発表者名: Takahashi H, Ranjan A, Chen S, Suzuki H, Shibata M, Hirose T, Hirose H, Sasaki K, Abe R, Chen K, He Y, Zhang Y, Takigawa I, Tsukiyama T, Watanabe M, Fujii S, Iida M, Yamamoto J, Yamaguchi Y, Suzuki Y, Matsumoto M, Nakayama KI, Washburn P, Saraf A, Florens L, Sato S, Tomomori-Sato C, Conaway RC, Conaway JW, Hatakeyama S
  • 雑誌名: Nature Communications 巻: 11 ページ: 1-20
  • DOI: 10.1038/s41467-020-14849-1
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [学会発表] 幹細胞特異的ユビキチンリガーゼRNF43の遺伝子変異による多段階発がんステップの起動と完成 (2019)
  • 著者名/発表者名: 築山忠維・石谷太・畠山鎮次
  • 学会等名: 第78回日本癌学会学術総会
• [学会発表] RNF43の遺伝子変異は多段階発がんステップにおいてWntとp53経路の変異を代償する (2019)
  • 著者名/発表者名: 築山忠維・篠裕輝・寺井小百合・高橋秀尚・BK Koo・石谷太・畠山鎮次
  • 学会等名: 第43回日本分子生物学会年会
• [備考] 北海道大学大学院医学研究院医化学教室
  • URL: https://hokudai-ikagaku.jp