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2019 年度 実施状況報告書

オルガノイド培養を用いた難治性乳がんにおける休眠スイッチと悪性化分子機構の解明

研究課題

研究課題/領域番号 19K07635
研究機関千葉大学

研究代表者

中山 哲俊  千葉大学, 大学院医学研究院, 特任助教 (10835226)

研究分担者 田中 知明  千葉大学, 大学院医学研究院, 教授 (50447299)
山形 一行  千葉大学, 大学院医学研究院, 助教 (60455912)
永野 秀和  千葉大学, 大学院医学研究院, 特任助教 (60788876)
研究期間 (年度) 2019-04-01 – 2022-03-31
キーワード乳癌 / p53 / 癌抑制遺伝子 / 3次元培養 / 休眠
研究実績の概要

本研究では、がん抑制遺伝子p53の変異がもたらす"gain of function"が腫瘍起源性(cancer initiating)やコレステロール合成系を介し、どの様にがんの増悪に関与しているのか、その作用機序を通してホルモン感受性がん、特に乳がんの悪性化分子機構と休眠スイッチ機構の解明を目的といている。
これまでの研究において、CRISPR/Cas9を用いてMCF7乳癌細胞株をp53変異型(R280K)に組み替えたノックイン(KI)細胞株を作成した。同時に、同じ細胞株でのp53の違いを明らかにするためにCRISPR/Cas9により作成したMDA-231p53KO細胞株にTet-On Systemを用い、 Doxycycline(Dox)依存的p53WT発現細胞株を作成した。さらに、元々の形質である変異p53(R280K)を発現する株も作成し、それらとp53KO細胞株を使用し、Doxによりp53を発現させた状態で3次元培養を行い、同じ細胞種でのp53の違いによるがん悪性化形態の差を確認した。これらは、MCF7乳がん細胞株でのp53の違いによる形態変化でも同様の結果となり、p53(R280K)のgain of functionががんの悪性化に重要であることを確認した。また、それらを用い2次元培養・3次元培養状態でのRNA-seq及びノンターゲットプロテオミクスの準備を現在行っている。今後、それらの結果を元に変異p53特異的新規がん悪性化遺伝子候補、特にがんで重要な代謝経路であるメバロン酸経路に関連する遺伝子の同定を行い、今回樹立した細胞株を用いSREBP2の結合分子解析、休眠スイッチ機構の解明につなげる予定である。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

CRISPR/Cas9を用いMCF7p53(R280K)KI細胞株の作成ができ、さらにMDA-231p53KO細胞株を用いDox依存的p53WT、変異p53R280K発現細胞株を作成することによりR280Kの変異ががん悪性化に関与していることが確認できた。また、それらを用いRNA-seq及びノンターゲットプロテオミクスの準備ができた。

今後の研究の推進方策

今後は、現在行っているRNA-seq及びノンターゲットプロテオミクス解析の結果から、変異p53特異的新規がん悪性化候補遺伝子の同定を行う。その作用メカニズムをLC-MS/MS やChIP-seqを用いて解析することにより、変異p53によるがん悪性化機構の解明を行う。また、シングルセル解析技術を用いて単一細胞レベルでの増殖状態・休眠状態間の比較解析を行う。それらのin vivoでの検討を行うため、3次元培養した細胞や休眠細胞をマウスに移植しての確認実験も行う予定である。

  • 研究成果

    (7件)

すべて 2020 2019 その他

すべて 雑誌論文 (2件) (うち査読あり 2件、 オープンアクセス 1件) 学会発表 (4件) (うち国際学会 1件) 備考 (1件)

  • [雑誌論文] Monoamine oxidase B rs1799836 G allele polymorphism is a risk factor for early development of levodopa-induced dyskinesia in Parkinson's disease.2020

    • 著者名/発表者名
      Kakinuma S, Beppu M, Sawai S, Nakayama A, Hirano S, Yamanaka Y, Yamamoto T, Masafumi C, Aisihaer X, Aersilan A, Gao Y, Sato K, Sakae I, Ishige T, Nishimura M, Matsushita K, Satoh M, Nomura F, Kuwabara S, Tanaka T.
    • 雑誌名

      eNeurologicalSci.

      巻: 19 ページ: 100239

    • DOI

      10.1016/j.ensci.2020.100239

    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] A Case of Hashimoto’s Thyroiditis with Multiple Drug Resistance and High Expression of Efflux Transporters2019

    • 著者名/発表者名
      Yoshida T, Nakayama A, Tamura A, Higuchi S, Sakuma I, Nagano H, Saulo J.A. Felizola, Takemoto M, Tatsuno I, Koide H, Yokote K, Tanaka T
    • 雑誌名

      The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism

      巻: 105 ページ: 399~406

    • DOI

      10.1210/clinem/dgz073

    • 査読あり
  • [学会発表] Cooperative Mechanism of SREBP-Dependent Cholesterol Synthesis Pathway and P53 on Malignant Formation in Breast Cancer2020

    • 著者名/発表者名
      Akitoshi Nakayama, Masataka Yokoyama, Hidekazu Nagano, Ikki Sakuma, Naoko Hashimoto, Seiichiro Higuchi, Kazuyuki Yamagata, Tomoaki Tanaka
    • 学会等名
      Endocrine Society’s Annual Meeting, San Francisco, CA, United States. (Conference canceled)
    • 国際学会
  • [学会発表] 乳がん悪性化分子基盤に対するp53,RBネットワークとGATA3結合因子RuvBL2の役割2019

    • 著者名/発表者名
      中山 哲俊、横山 真隆、永野 秀和、山形 一行、橋本 直子、田中 知明
    • 学会等名
      第42回日本分子生物学会年会
  • [学会発表] Mechanistic Role of p53-RB-GATA3 Network in Regulation of Malignant Signature for Breast Cancer Formation2019

    • 著者名/発表者名
      Akitoshi Nakayama, Hidekazu Nagano, Masataka Yokoyama, Kazuyuki Yamagata, Naoko Hashimoto, Tomoaki Tanaka
    • 学会等名
      第78回日本癌学会学術総会
  • [学会発表] 乳がん悪性化分子基盤におけるp53,RB,GATA3ネットワークの役割2019

    • 著者名/発表者名
      中山 哲俊、永野 秀和、田中 知明
    • 学会等名
      第92回日本内分泌学会学術総会
  • [備考] 千葉大学大学院医学研究院分子病態解析学

    • URL

      https://www.m.chiba-u.ac.jp/class/moldiag/

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公開日: 2021-01-27  

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