| 研究課題/領域番号 |
19K07654
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| 研究機関 | 千葉県がんセンター(研究所) |
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研究代表者 |
竹永 啓三 千葉県がんセンター(研究所), がん遺伝創薬研究室, 特任研究員 (80260256)
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| 研究分担者 |
越川 信子 千葉県がんセンター(研究所), がん遺伝創薬研究室, 主任上席研究員 (90260249)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | ミトコンドリア / ミトコンドリアDNA / 細胞外小胞 / 細胞間移行 |
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| 研究実績の概要 |
マウス肺がん由来で野生型ミトコンドリアDNA(mtDNA)を有するP29細胞およびND６遺伝子中にG13997A変異が存在するmtDNAを有するP29細胞を、それぞれMitoTracker Deep RedおよびCellLight mitochondria-GFPで標識し24時間共培養を行ったところ、それぞれの蛍光色がお互いの細胞で観察され、ミトコンドリアの移行が細胞間で起きていることが示唆された。また、A11細胞―マクロファージ間でも移行が起きることも判った。それぞれの蛍光が粒子状に観察されたため、細胞外小胞を介してミトコンドリアが移行した可能性が考えられた。そこで、A11細胞が放出する細胞外小胞中にmtDNAが存在するかどうかを検討した。細胞外小胞は通常の超遠心法および市販のキットを用いて調製しPCRを行ったところ、mtDNAの存在が確認された。また、G13997A変異を特異的に検出するためにミスマッチプライマーを用いたPCR-RFLP解析を行ったところ、この変異を有するmtDNAが存在していることが判った。さらに、他のマウスおよびヒト由来の各種がん細胞および正常細胞が放出する細胞外小胞中にもmtDNAが存在することが判ったが、がん細胞の方が多量のmtDNA含有細胞外小胞を放出することが明らかになった。A11細胞およびHeLa細胞が放出した細胞外小胞を、それぞれmtDNA-lessのrho0P29細胞およびrho0HeLa細胞に処理し、２日後に細胞内にmtDNAが入っているかどうかをPCRで調べたところ、mtDNAが存在していることが判った。しかし、１週間後に調べるとmtDNAが検出できなくなり、mtDNAが排除されたことが考えられた。ミトコンドリアの排除を抑制することで移行させたミトコンドリアが安定的に維持されるかどうかを検討する必要がある。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
研究目的の一つとして、細胞外小胞を介したミトコンドリアDNA(mtDNA)の細胞間移行を上げているが、これに関しては概ね順調にデータを得ている。しかし、mtDNA-less細胞に移入したmtDNAが安定に保たれないなど予期せぬ自体が生じている。また、もう一つの研究目的として、G3394CあるいはC3497T SNPsががん細胞の転移能に及ぼす影響を検討することを上げているが、これらのSNPsを有する細胞材料が今のところ見つかっておらず、研究が滞っている。
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| 今後の研究の推進方策 |
mtDNA-less細胞中では移入されたミトコンドリアが不安定になりマイトファジーで排除される可能性が考えられるため、マイトファジーを抑制する薬剤や細胞内でミトコンドリアの融合・分裂を活性化する薬剤の処理により、ミトコンドリアが安定的に維持されるかどうかを検討する必要がある。さらに、野生型mtDNAを有する細胞への移入を考える必要がある。しかし、この場合には移入されたミトコンドリアの量が微量であるため、それが増えてくるまでの培養期間の検討や検出するための方法論の開発等が必要になる。G3394CあるいはC3497T SNPsを有する細胞材料については引き続き検索を進めて行く。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
来年度に高額の試薬を購入予定のために残した。細胞外小胞の調製用試薬を購入予定である。
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