| 研究課題/領域番号 |
19K07669
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| 研究機関 | 琉球大学 |
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研究代表者 |
大野 真治 琉球大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (50419529)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | ヘルペスウイルス / 古典型カポジ肉腫 |
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| 研究実績の概要 |
ヒトヘルペスウイルス８の持続感染細胞であるBCBL-1からゲノムDNAやRNAを抽出し、PCRおよび逆転写PCR法を用いて標的遺伝子（ORF24、ORF26、ORF30、ORF42、ORF70、ORF72、vIRF1、vIRF2、K1）を発現プラスミドにサブクローニングし、配列を確認した。タンパク質発現の確認を容易にするためにタンパク質のC末端領域にFLAGタグエピトープ配列を付加した。
HEK293T細胞にプラスミドを導入し、ウエスタンブロット法で発現を確認した。タンパク質の発現が確認できたORF26、ORF42、ORF70、ORF72のうち、ORF42を除く3つの遺伝子について宮古島のウイルスでみられる遺伝子変異を導入し、上記と同様の発現プラスミドを作成した。
HEK293T細胞にプラスミドを導入し、ウエスタンブロット法で宮古島型と野生型のタンパク質の発現に差がないことを確認した。また、Hela細胞にプラスミドを導入し、間接蛍光法でタンパク質の局在を調べた。宮古島型のアミノ酸変異の有無にかかわらず細胞k内局在に違いがないことを確認した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
宮古島のウイルスに特徴的な変異を導入した（宮古島型）遺伝子発現プラスミドと野生型遺伝子の発現プラスミドを作成し、発現を確認できた3つの遺伝子（ORF26、ORF70、ORF72）について解析を行うことができた。現在はこれらの安定発現細胞を樹立中である。2019年度のマイルストーンは安定発現細胞株の樹立であることから、おおむね順調に進展していると評価した。
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| 今後の研究の推進方策 |
現在、野生型3遺伝子と宮古島型3遺伝子について遺伝子の安定発現細胞を作成中であり、今後造腫瘍能について評価する予定である。また、それ以外の遺伝子についても発現プラスミドを作成しなおし、同様の評価を行う予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
共通機器の利用を想定していたが、近隣の研究室が利用予定の機器を所有していることがわかり、その分の使用料負担が軽減されたためである。
2020年度に大学院生が入学する。本研究課題の支援のために学生が使用する消耗品等が増えることが見込まれるため、その分に使用する。
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