| 研究課題/領域番号 |
19K07686
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| 研究機関 | 金沢大学 |
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研究代表者 |
石村 昭彦 金沢大学, がん進展制御研究所, 助教 (80375261)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | エピジェネティクス / 乳がん / がん悪性進展 / がん細胞 |
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| 研究実績の概要 |
がんの発生・悪性進展過程において、がんに関係する遺伝子自身の異常（ドライバー変異）のみならず、その遺伝子を取り巻く環境の変化（エピジェネティック変異）が高頻度に報告されている。しかし、両者の相互作用とそれが及ぼす影響は、意外なほど理解されていない。本研究では、ゲノム編集技術を用いて、代表的なドライバー変異を人為的に導入した乳がん細胞を作製した。そして、作製された変異細胞で誘導された悪性形質を増悪させる因子を、120種類のエピジェネティック制御因子に標的を絞った“目的特化型 CRISPR/Cas9 スクリーニング法”によって同定を試みた。
乳がんで最も高頻度に遺伝子の不活性化や変異が観察されている「P53」遺伝子を人為的に欠損させた乳がん細胞を用いて、がん悪性化の指標のひとつ「スフィア形成能＝がん幹細胞性」を増幅する因子のスクリーニングを行った。その結果、これまで乳がんについて報告のないヒストン脱メチル化酵素（KDM）Xを含む、複数の候補遺伝子の同定に成功した。細胞学的解析の結果、KDM "X"を乳がん細胞内でノックダウンした際、「スフィア形成能」や「細胞浸潤能」の上昇が観察され、新規のがん抑制遺伝子である可能性が示唆された。一方、P53と同じく乳がん悪性化との関係性が示唆されている、変異型KRASを人為的に発現させた乳がん細胞を用いて同様のスクリーニングを行った結果、KDM "Y" が乳がん悪性化因子のひとつとして同定された。以上より、ドライバー変異依存的に、異なるエピジェネティック制御因子が乳がん悪性進展過程に寄与する可能性が強く示唆され、今後、両者の因果関係を明らかにし、ドライバー変異を起点としたエピジェネティックな発現制御異常と乳がん悪性化の関係性を明らかにしていきたい。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
これまで研究代表者らは120種類のエピジェネティック制御因子に標的を絞ったsgRNAライブラリーを作製し、乳がん悪性化の関係する因子のCRISPR/Cas9スクリーニングを行ってきた。その結果、KDM3B、KDM7B、KDM8、PRMT6、ASH2Lといった複数の候補遺伝子の同定に成功した。TCGAデータを用いた発現解析の結果、KDM3BやKDM8は、トリプルネガティヴ型乳がん患者組織内で有意に発現が低下しており、新規の乳がん悪性化因子の可能性が示唆されている。特にKDM3Bに関しては、shRNAを用いたノックダウン実験の結果、その遺伝子の不活性化が細胞実験レベルでもスフィア形成能や細胞浸潤といった乳がん悪性形質の獲得に強く関係することを示された。一方、sgRNAによる標的遺伝子の不活性化でスフィア形成能が低下＝悪性度が低下する因子として同定されたPRMT6やASH2Lは、乳がん組織で発現が高頻度に上昇していることが既に報告されている。以上より、これまで研究代表者らが取り組んできたCRISPR/Cas9スクリーニングは、非常に効率よく乳がん悪性化に関わるエピジェネティック制御因子候補を絞り込める実験系である可能性が示唆された。そして、本スクリーニングを遂行することによって、（本研究の目的である）ドライバー変異を起点としたエピジェネティックな発現制御異常と乳がん悪性化との関係性を明らかにできることが大いに期待出来た。
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| 今後の研究の推進方策 |
本研究課題で計画された（P53欠損MCF7細胞を用いた）CRISPR/Cas9スクリーニングをさらに遂行し、乳がん悪性化に関わる、新規エピジェネティック制御因子の同定を試みる。そして、得られた候補遺伝子に関して培養細胞を用いた検証実験を行うと同時に、TCGAデータ等を利用した臨床サンプルとの相関性を明らかにする。また、別のドライバー変異を導入したがん細胞（例えば、変異型P53を発現させたP53欠損MCF7細胞）を用いて、様々な悪性形質獲得（例えば、スフィア形成能、細胞浸潤能、薬剤耐性能）を指標にCRISPR/Cas9スクリーニングを行い、がん悪性化因子の同定を試みる。
これまで同定された候補遺伝子のうち、KDM3Bは細胞実験と臨床データを用いた発現解析の両方で乳がん悪性化に関わる可能性が示唆されている。従って、KDM3Bを最も有力な乳がん悪性化に関わる新規がん抑制遺伝子として注目し、以下に示す方法でこのときの作用メカニズムを分子レベルで明らかにしていく。
（1）マイクロアレイを利用したトランスクリプトーム解析
（2）MASS解析を利用したKDM3B結合タンパク質の同定
（3）計画（1）と計画（2）で得られた情報を元にCandidate approchを行う。そして、KDM3B不活性化に伴う乳がん悪性化の作用機序を分子レベルで明らかにし、KDM3Bが司るエピジェネティック制御の可塑性を標的とした、乳がん悪性進展に対抗しうる分子標的戦略の開発に繋げる。
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