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ゲノム編集タンパク質精製システムの構築 - 近年、CRISPR/Cas9ヌクレアーゼの精製タンパク質を一般に入手できるようになり、目的細胞でのゲノム編集がより簡便となり、従来のCRISPR/Cas9発現プラスミドやRNA、ウィルス導入と比べてゲノム編集効率が飛躍的に高まった。申請者は、従来の大腸菌タンパク質発現系を用いて、高精度型Cas9であるHypaCas9タンパク質をgRNAと同時に大腸菌で発現させ、リボヌクレオプロテイン(Ribonucleoprotein(RNP))として精製するシステムを構築中であるが、Cas9タンパク質合成の際に一般的に用いられている大腸菌株Rosetta(DE3)を用いてタンパク質発現を行った場合、様々な可溶性タンパク質(タグ)を融合させてみたが、精製タンパク質は得られなかった。ごく近年、Cas9タンパク質合成について、大腸菌株BL21(DE3)とRosetta(DE3)で比較した論文が報告され、この論文によるとRosetta(DE3)ではmRNAレベルがはるかに低いため、微量のCas9タンパク質しか検出できなかったのに対し、BL21(DE3)ではタンパク質発現の改善が見られた。また、高分子量タンパク質を合成する際は低温(18℃など)で発現誘導するのが一般的とされているのに対し、この論文では30℃での発現誘導にて最大発現量が得られた。そこで申請者も同様にBL21(DE3)を用いてHypaCas9タンパク質を発現誘導しところ、十分なタンパク質発現が得られた。大腸菌破砕方法は凍結融解法ならびにリゾチームを用いてマイルドな条件でタンパク質抽出を行うことで、夾雑タンパク質の減少によりシングルバンドでタンパク質を精製することができた。今後、自作HypaCas9 RNPを培養細胞に導入し、目的遺伝子ノックアウト/インの確認を行う予定である。
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