| 研究課題/領域番号 |
19K07701
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| 研究機関 | 公益財団法人がん研究会 |
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研究代表者 |
高野 洋志 公益財団法人がん研究会, がん研究所 細胞生物部, 主任研究員 (00241555)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | 大腸がん / モデルマウス / 染色体構造異常 / ゲノム編集 |
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| 研究実績の概要 |
本研究課題では、大腸がんの進展に関わるゲノム構造の異常を明らかにすることを目的として、ゲノム編集により染色体異常を誘導する新たな実験系を開発し、大腸がんモデルマウスに導入する。これにより、CNAをはじめとするゲノム異常が実際にがんの進展に寄与することを実証し、さらに、同定されたゲノム異常を詳細に解析することにより、大腸がん進展の鍵となる遺伝子を同定する。
本年度は、染色体異常を誘導するための反復配列を標的としたガイドRNA発現マウスの作製を行った。標的配列がゲノム上に多数存在するB1 SINEガイドRNA発現ユニットをROSA26遺伝子座にゲノム編集によりノックインを試みたが、目的とするマウスを樹立することはできなかった。
その一因として、反復配列を標的としたガイドRNAの恒常的な発現がマウスの発生に有害であることが考えられたことから、今後、特定の染色体もしくはその一部を標的としてゲノム編集により欠失させるマウスを作製する。また、反復配列を標的としたゲノム編集をin vivoで行うシステムの構築を試みる。
これらのシステムを用いて消化管腫瘍マウスで染色体異常を誘導し、ゲノム異常とがんの進展との関連を明らかにする。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
ガイドRNA発現ユニットをゲノムに組み込んだ新たなゲノム編集によるコンディショナル・ノックアウトシステムを開発することに成功した。さらに、このシステムにCas9ガイドRNA発現ユニットを導入したPulse Gene Editingシステムの開発に成功した。
この消化管腫瘍腫瘍モデルマウスにおいて腸幹細胞特異的に反復配列を標的としてゲノム編集を行うために、B1 SINEを標的としたガイドRNA発現ユニットをROSA26遺伝子座にノックインしたマウスの作製を試みたが、いまだ作出するに至っていない。
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| 今後の研究の推進方策 |
当初は、反復配列を標的としてゲノム編集を行うことによりゲノム再構成を誘導するというストラテジーだったが、B1 SINEガイドRNA発現マウスは得られていない。その一因として、B1 SINEガイドRNAの標的配列がゲノム上に１２００カ所存在し、その恒常的な発現がマウスの発生に有害であることが考えられる。そこで、特定の染色体もしくはその一部をゲノム編集により欠失させる。具体的にはヒト大腸がんで頻繁にaneuploidyが認められる１８番染色体のシンテニー領域を欠失させるように設定したガイドRNAを発現するマウスを作製し、消化管腫瘍モデルマウスに導入してaneuploidyを誘導し、腫瘍数、腫瘍サイズ、腫瘍形成の時期、浸潤・転移の有無について詳細に解析する。
これらの腫瘍について、病理組織学的解析ならびに幹細胞マーカー（Lgr5やOLFM4など）や増殖細胞のマーカー（PCNAなど）、分化細胞のマーカー（LysozymeやCK15など）の免疫染色、in situハイブリダイゼーションによる発現解析を行うことにより、個々の腫瘍の性格付けを行う。さらに、これらの腫瘍からレーザーマクロダイセクションによりDNAを抽出し、SNPアレイならびに全ゲノムシーケンス解析によりCNAを検出し、ヒト大腸がんで明らかにされているCNAデータと比較検討することにより、がんの進展・悪性化に関わるゲノム領域を同定を目指す。
また、DEAE-Dextran MMA共重合体を用いたin vivoでのゲノム編集について検討し、消化管腫瘍モデルマウスの大腸腫瘍に直接、B1 SINEガイドRNAーCas9タンパク複合体を注入することにより、染色体再構成を誘導し、同様の解析を行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
染色体再構成マウスの作製が計画通り進まず、解析に進むことができなかったことに加えて、コロナ感染による研究活動自粛により、当初の見積もりから差額が生じ、次年度に繰り越した。
翌年分として請求した助成金と合わせて、染色体再構成マウスの作製と解析に充当していく。
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