| 研究課題/領域番号 |
19K07703
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| 研究機関 | 国立研究開発法人国立がん研究センター |
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研究代表者 |
碇 直樹 国立研究開発法人国立がん研究センター, 研究所, 研究員 (30649471)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | Mieap / 液滴 / 鉄 / イメージング |
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| 研究実績の概要 |
Mieapと鉄の輸送機構との関連を検討するため、Mieap発現時に形成される液胞様構造物のプルシアンブルー染色、Mito-FerroGreen投与後のライブセルイメージングを行い、液胞様構造物と鉄との関連についての評価を行った。また、細胞膜に挿入される鉄感受性の蛍光プローブを用いて鉄の挙動をエンドサイトーシスとの関連とともにライブセルイメージングにて解析した。その結果、Mieap発現時に形成される液胞様構造物には、上記膜の標識プローブで検出される膜が存在しないことを発見し、さらに蛍光タグで可視化した Mieapは液滴を形成し、ミトコンドリアを液-液相分離することをつきとめた。
さらに、Mieap液滴が、これまで一見膜に裏打ちされた液胞様に観察されていた原因について、蛍光タグ付きMieap発現ベクターと免疫染色を組み合わせたイメージングを施行し明らかにした。液-液相分離の見地より、Mieap蛋白の配列のin silico解析（天然変性領域、荷電、親水/疎水領域、orthologとの比較）、fluorescence recovery after photobleaching（光褪色後蛍光回復）法によるMieap液滴の液滴としての性質の特徴づけを行った。さらに、各種蛍光タグ付き発現ベクターを用いたライブセルイメージングを行い、Mieap液滴と発現蛋白との局在関係の対比より、Mieap液滴がミトコンドリア内に形成されることも明らかにした。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
本研究開始時においては、予定どおりMieap発現時に形成される液胞様構造物の由来・鉄との関連について、オルガネラの膜融合に着目し、膜を前提とした輸送機構の検討から着手した。しかし、Mieapと鉄の輸送機構との関連を検討する過程で、Mieap発現時に形成される液胞様構造物が、膜を伴わない液滴であることを発見した。このことは、当初予期していないことであった。しかし、膜を伴わない、区画化された機能領域として、全く新しいミトコンドリアの液-液相分離の発見につながった。
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| 今後の研究の推進方策 |
膜でなく液-液相分離の観点から、引き続きMieapの機能について解析を進める。具体的には、Mieapと直接相互作用する分子・Mieapが相分離する分子を、蛍光タグ付き発現ベクターを用いた共焦点顕微鏡法・抗体を用いた免疫電子顕微鏡法で特定し、当初の研究課題である鉄・細胞死との関連を明らかにする。また、Mieapによる液-液相分離が増強される条件、液滴が拡散する条件の解析を行い、これらと鉄・細胞死との関連を明らかにする。さらに、液滴の形成に影響するとされる天然変性領域を欠失させた変異Mieap、あるいは天然変性領域外を欠失させた変異Mieapの発現ベクターを用いて、Mieap液滴の変化を解析し、鉄・細胞死との関連の変化を明らかにし、Mieapの機能を領域ごとに細分化する。
上記のごとく、液-液相分離の観点から解析を進め、Mieapと鉄・細胞死との関連を検討することで、引き続き当初の本研究課題の目的である、将来のp53-Mieap経路を標的とした治療応用のためのシーズを導出へ向けて、研究を推進する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
前年度に、Mieapと鉄の輸送機構との関連を明確化すべく、鉄輸送に関連した膜蛋白の分布・発現変化を蛍光免疫染色とWestern blottingで解析する予定であった。しかし、Mieap発現時に形成される液胞様構造物は、膜を伴わない液-液相分離の特徴を示した。そこで、計画を変更し、Mieap発現時に形成される液胞様構造物が液滴であることの確認、液滴としての性質の特徴づけを行ったため、未使用額が生じた。このため、膜でなく液-液相分離の観点から引き続きMieapの機能についての解析を次年度に行うこととし、未使用額はその経費に充てる。
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