2019 年度実施状況報告書

細胞膜タンパクSdc4を標的とした癌幹細胞の診断と治療

研究課題

研究課題/領域番号	19K07713
研究機関	大阪大学
研究代表者	呉しん大阪大学, 医学系研究科, 招へい教員 (00764739)
研究分担者	山本浩文大阪大学, 医学系研究科, 教授 (30322184)
研究期間 (年度)	2019-04-01 – 2022-03-31
キーワード	Sdc４ / 癌幹細胞
研究実績の概要	癌組織は自己複製能や多分化能を有し、子孫の細胞を作り続ける少数の細胞集団（癌幹細胞）と最終的に腫瘍形成能を失う細胞集団（非癌幹細胞）の二群からなる。現在臨床で行われている抗癌剤治療や放射線治療によって非癌幹細胞は死滅するが、治療抵抗性を示す癌幹細胞集団は生き残り、これが後に癌の再発や転移をきたす。私達はこれまでに、膵臓癌細胞株を用いて、一個の細胞からマウスに癌組織を作る「スーパー癌幹細胞」を樹立し、そのドライバー遺伝子としてSdc4を見出した。Sdc4は細胞膜に発現するタンパクであるため、FACSによる癌幹細胞診断マーカーや、抗体治療の標的となる可能性も考えられる。本研究課題では① 癌幹細胞に対してSdc4がどのように特異的な機能を賦与するのか、そのメカニズムを解明すること、② Sdc4の癌幹細胞としての普遍性を細胞株（食道・膵臓・大腸）と臨床サンプルで確認して癌幹細胞診断マーカーとしての意義を明らかとすること、③ Sdc4を標的とした治療剤（抗体、核酸）を作製することを目的として診断・治療の両面から癌の根治を目指す。初年度は、次項に記するように、核酸の選定、臨床サンプルの確保、癌幹細胞のモデル細胞の確立など研究計画全体の準備となる基礎を固めることができた。Sdc4-siRNAと既存の治療薬（オキサリプラチン、ラパマイシン、Wnt阻害剤）との併用によって治療抵抗性の難治性癌が全滅に近づいたことからも、癌幹細胞の駆逐に向けた本研究の意義は大きく、Sdc4抗体陽性細胞の診断、治療に向けたモノクローナル抗体取得を中心として次年度に進めてゆく。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 2: おおむね順調に進展している理由令和元年度は、① 臨床サンプルとして大腸癌、食道癌、膵臓癌のパラフィンブロックから切片を切り出し、Sdc4の免疫染色用の抗体を複数検討し最適な抗体の選定を行った。②　Sdc4を抑制するsiRNAを市販品の中で３種類、独自に７種類を設計し、Sdc4発現を効率よくノックダウンさせる配列を決定した。③ 膵癌、大腸癌についての癌幹細胞モデル細胞をそれぞれ細胞株と臨床検体から樹立した。FACSにより膵管や皮膚由来の正常細胞ではSdc4の発現がみられず、癌幹細胞モデル細胞ではSdc4を高発現することが分かった。④ Sdc4 siRNAは正常細胞には影響を与えず、一方、２種の癌幹細胞モデル細胞の多くはSdc4 siRNAによって死滅した。以上の成果から、初年度は当初の目標に向けて順調に進んでいるといえる。
今後の研究の推進方策	初年度はSdc4発現をノックダウンする核酸配列を決定した。次年度は診断薬や治療剤となるSdc4のモノクローナル抗体の取得に向けてハイブリドーマを作成し多数のクローンの選別を行うとともに、in vitro, in vivo実験を進める。In vivo実験として、まずヌードマウスに癌幹細胞由来の皮下腫瘍を作成しSdc4-siRNAを静注して抗腫瘍効果を検討する。In vitro実験としては、癌幹細胞モデル細胞を用いて、Sdc4陽性分画とSdc4陰性分画で、 RNAseqによって得られた発現プロファイルを比較し、Gene Ontology analysis、IPA (Ingenuity Pathway Analysis) 解析を行う。 Sdc4の下流にあるシグナル伝達系が正常細胞、非癌幹細胞と、癌幹細胞で各々どの程度に活性化されているかを明らかとする。リガンド候補であるFGF2, R-spondinの添加の有無の条件でウエスタンブロットを行い関連分子の発現を検討する。またFACS で Sdc4 陽性分画と陰性分画に分離し、幹細胞マーカー発現（CD133, CD44, CD44v9, Lgr5, Dclk1, など）、 sphere 形成能、ROS 産生能、抗癌剤耐性（5FU, Gem, L-OHP）について検討する,などを行う。