| 研究課題/領域番号 |
19K07740
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| 研究機関 | 順天堂大学 |
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研究代表者 |
加藤 俊介 順天堂大学, 大学院医学研究科, 教授 (40312657)
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| 研究分担者 |
藤井 智明 順天堂大学, 医学部, 非常勤助教 (10511420)
山口 茂夫 順天堂大学, 医学部, 非常勤助教 (40747797)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | BRAF / long non-coding RNA / シグナル依存 / 薬剤感受性 |
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| 研究実績の概要 |
BRAF遺伝子のV600に生じるミスセンス変異は機能活性化変異であり、様々な固形癌において臓器横断的に変異が報告されている代表的なドライバー変異であるが、BRAF阻害剤に対する感受性は由来臓器に依存して大きく異なっていることが知られており、臓器横断的治療に基づく薬剤開発をしていく上での課題となっている。本課題では、臓器特異的な発現パターンを有するlong non-coding RNA（以下lncRNA）が、BRAF変異に対する依存性に影響を及ぼすと想定し、そのlncRNA同定を目的に細胞実験を計画した。しかし進捗に遅れがみられることから、in silicoでの解析も行っている。
細胞実験では、CRISPR-dCas9遺伝子発現活性化システムと標的lncRNAの転写部位へのガイドRNAを用いて、網羅的な解析を計画し、BRAF阻害剤非感受性株としてRKO細胞、BRAF阻害剤感受性株として A375細胞にdCas9-VP64 とMS2-P65-HSF1を安定発現できる細胞株を樹立した。次に10,504か所のlncRNA転写開始点に対応するsgRNAライブラリーを、レンチウィルスを用いて導入発現させるためのマススクリーニングに着手したが、RKO細胞はゼオシンによるセレクションが細胞が密な状態では困難であったため、A375細胞で導入準備を行っている。今後、Dabrafenibの存在/非存在下で生存する細胞からgDNAを抽出し、sgRNA領域をPCRにて増幅し、次世代シークエンサーにて解析を行う予定である。
同時に公共データベース（TANRIC, DepMap）を用いてin silicoでの解析にも着手した。BRAF変異を有する悪性黒色腫、大腸癌検体から、発現レベルが異なるlncRNA（悪性黒色腫で発現上昇がみられる174の lncRNA、発現低下がみられる27のlncRNA）を同定した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
レンチウィルス感染RKO細胞のセレクションに用いるゼオシンの濃度が、スクリーニングに用いる細胞濃度では効率よく働かないことが判明し、その後のダブラフェニブ感受性実験のデータに影響を与える可能性が示唆されたため、感染予定細胞を変更して行う必要が出たため、対応が遅れている。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後、細胞実験を遂行していくとともに、候補として単離されたlncRNAの機能解析についてはin silicoでの解析も行っていく。
また、TANRICデータベースから同定したlncRNA（悪性黒色腫で発現上昇がみられる174の lncRNA、発現低下がみられる27のlncRNA）について、これらlncRNAの発現とBRAF変異を有する培養細胞株のDabrafenibに対する感受性との間に相関があるlncRNAをDepMAPのデータも利用して２つ同定している。今後、細胞実験で得られたデータの解釈の参考に用いていく。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
物品購入時に端数の金額が生じてしまったため。
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