| 研究課題/領域番号 |
19K07745
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| 研究機関 | 国立研究開発法人国立がん研究センター |
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研究代表者 |
山下 聡 国立研究開発法人国立がん研究センター, 研究所, ユニット長 (80321876)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | 突然変異 |
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| 研究実績の概要 |
発がん要因と関連した変異の特徴（シグネチャー）は、要因の同定やがんの予防・治療の研究に重要である。本研究では、非がん組織の突然変異を測定し、各個人の組織における変異シグネチャーを解明する。そのために初年度である今年度は、まず、申請者が以前に開発した超低頻度の点突然変異頻度解析法（特願2015-199342）の改良を行った。超低頻度の点突然変異を解析する場合、両ストランドに同一の変異が存在する場合は真の変異であるが、片側にのみ存在する場合はpre-mutagenic lesionと考えられるので、真の変異のみを検出する必要がある。その区別を行うには分子バーコードの導入が不可欠であり、まず、QIAseq Targeted DNA Panels（Actionable solid tumor panel / 15,160塩基）を用いて分子バーコードの有用性の確認を行った。しかしながら、この方法では同一DNA二本鎖に由来する二鎖はそれぞれ別の分子として増幅されている。そのために同一バーコードを持つ両方のストランドからリードを得るには大量のリード数を必要とした。この問題は、検討により情報処理での解決は難しいことが明確になった。そこで(1)二鎖に同一の分子バーコードが付与されるDuplex法の導入、(2)両ストランドを分離させないで増幅する新規の方法の開発、を進めた。(1)については、申請者が以前に開発した超低頻度の点突然変異頻度解析法の特徴である、シークエンシングのテンプレートDNA分子数を少なくすることで、必要なリード数を少なくし、多くの検体の解析を可能にするために、測定する（ライブラリのテンプレートになる）ゲノム領域を制限酵素で処理することで限定する改良を導入した。 (2)については、両ストランドを同時にシークエンシングするためのアダブター、ポリメラーゼの検討を進めた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
今年度の研究実施計画の大要である、超低頻度突然変異頻度解析方法の高精度化のために、これまでに申請者らが開発した方法に分子バーコードを導入する検討を進めた。まず、QIAseq Targeted DNA Panels（Actionable solid tumor panel / 15,160塩基）を用いた分子バーコードの有用性の確認は完了した。一方で、本法では同一バーコードを持つ両方のストランドからリードを得るには大量のリード数を必要とし、この問題は、情報処理での解決は難しいことが明らかになった。そこで本方の変異検索範囲を拡張した100,000塩基のcustomized panelを作製する方針はとらず、別法による高精度な超低頻度突然変異頻度解析方法の確立を進めた。ライブラリ作成の反応条件の検討が進んでいるが、変異検出のパラメーター条件（一つのUMI中の最低リード数、同一の鋳型分子由来とする配列の一致率など）の最適化には至っていない。
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| 今後の研究の推進方策 |
申請者が以前に開発した超低頻度の突然変異を測定する方法に分子バーコードを付与することで更に高精度化する現在の検討をさらに進めて、高精度化した方法を確立する。そして本方法を用いてヒト食道がん患者の各個人の非がん組織に蓄積した突然変異を測定し、変異シグネチャーを解明する。喫煙・飲酒などの発がん要因曝露量の情報がある食道がん患者の非がん部合計100例のDNA（以前の研究の残余が使用可能）について、変異を2019年度に確立した方法で解析する。シークエンシングは１サンプルあたり10Gbaseで外注により行う予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
年度末近くに購入した物品が想定より安価だったなどの理由で１万円以下の残が生じた。次年度に実験用試薬などの物品代として使用する。
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