| 研究課題/領域番号 |
19K07761
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| 研究機関 | 愛知医科大学 |
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研究代表者 |
池野 正史 愛知医科大学, 医学部, 准教授 (80298546)
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| 研究分担者 |
難波 宏樹 浜松医科大学, 医学部, 教授 (60198405)
武内 恒成 愛知医科大学, 医学部, 教授 (90206946)
小泉 慎一郎 浜松医科大学, 医学部附属病院, 助教 (10456577)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | 遺伝子治療 / 細胞治療 / HSVtk / TERT |
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| 研究実績の概要 |
本研究では、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ(HSVtk)遺伝子とプロドラッグであるガンシクロビル(GCV) の投与による遺伝子細胞治療の確立のために、HSVtk遺伝子を安定に発現する組織幹細胞の作製を目標とした。間葉系幹細胞を含む複数種の幹細胞に、HSVtk遺伝子とhTERT遺伝子とを同時に導入することにより、十分な遊走能とバイスタンダー効果を保有する幹細胞を効率よく単クローン化する技術を開発し、治療細胞の安定供給を実現する。
本年度は、HSVtkおよびhTERTの発現コンストラクトをデザイン・作製し、複数種の組織幹細胞を対象に発現コンストラクト導入細胞の単クローン化を検討し、得られた単一細胞クローンの第一段階評価を行った。具体的には、自殺遺伝子のHSVtk遺伝子、細胞増殖に重要なhTERT遺伝子、導入の選択に必要なHygromycin耐性遺伝子、発現モニターとなるGFP遺伝子、合計４種の遺伝子を細胞内で安定に機能発現するためのDNAコンストラクトを作製した。安定かつ均一な機能発現のために、発現プロモーターをCAGとし、４種の遺伝子を同一コンストラクトに集約した。
また、遺伝的加工が困難な組織幹細胞に対して、トランスポゾンを原理としたウイルスフリーのPiggyBacシステムを利用して、４種連結の遺伝子発現コンストラクトを導入およびゲノム挿入した。その結果、複数種類の組織幹細胞においてHygromycin陽性の細胞クローンが再現的に得られ、hTERTおよびGFPの発現量を指標として細胞クローンを評価した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
４種連結の遺伝子コンストラクトの作製、および組織幹細胞への導入とゲノム挿入は計画通りに進み、マイルストーンに設定したPiggyBacシステムによるhygromycin陽性細胞クローンの再現的な樹立は達成された。一方、細胞クローンのゲノムを評価した結果、ゲノムに挿入後の発現コンストラクトにおいて、その一部が欠落する予想外の事象が生じた。また、発現量評価により、十分なバイスタンダー効果の発揮にはHSVtk遺伝子の発現量向上の必要性が示された。
これらの課題を解決するために、当初の計画に加えて、４種の遺伝子を２種遺伝子ずつに分割したコンストラクトへのデザイン変更、および発現プロモーターの変更などの見直しを進めている。
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| 今後の研究の推進方策 |
本研究では、組織幹細胞への遺伝子導入後の単クローン化の効率向上を目的にhTERT遺伝子を利用することが特徴の一つである。当該細胞はプロドラッグにより殺傷される原理であるため、hTERT遺伝子導入による腫瘍化のリスクが低い。一方で、遺伝子細胞治療において、治療細胞に外来hTERT遺伝子を保持することの是非は今後の検討課題であることから、hTERT遺伝子を単クローン化過程で一過的に機能させる方法を別途に進める。
特定の組織幹細胞において、TK遺伝子を長期間に発現した場合、細胞増殖に対して阻害的に働く可能性が示されたことにより、組織幹細胞の選定が新たな課題である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本年度の計画が予定通りに進み、細胞培養試薬およびプラスチック器具の使用量が計画より少量であったため。計画の見直しにより生じた追加作業に使用する。
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