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2019 年度 実施状況報告書

がんゲノム解析で蓄積する機能未知遺伝子変異の臨床活用にむけた変異機能推定法の構築

研究課題

研究課題/領域番号 19K07792
研究機関静岡県立静岡がんセンター(研究所)

研究代表者

芹澤 昌邦  静岡県立静岡がんセンター(研究所), その他部局等, 研究員 (00569915)

研究分担者 石川 吉伸  静岡県立大学, 薬学部, 准教授 (00305004)
大島 啓一  静岡県立静岡がんセンター(研究所), その他部局等, 研究員 (10399587)
釼持 広知  静岡県立静岡がんセンター(研究所), その他部局等, 研究員 (50602637)
盛 啓太  静岡県立静岡がんセンター(研究所), その他部局等, 研究員 (50727534)
研究期間 (年度) 2019-04-01 – 2022-03-31
キーワードがんゲノム医療 / 分子標的治療 / AI / VUS
研究実績の概要

本研究では、研究対象の遺伝子において日本人がん患者から検出された体細胞変異に対し選択基準を設けることなく網羅的に機能評価を行う。解析対象変異を培養細胞株において発現するためのプラスミドの構築において、当初有していた技術では繰り返し配列の領域における数十塩基の挿入・欠失などを含む約1~2割の変異に対応できていなかった。本年度行った技術改良により、新たに2種類の変異導入方法を確立した。この3種類の構築方法を適宜選択することでほぼすべての変異に対し対応可能となった。
培養細胞株において解析対象とする変異を一過性で発現するためのプラスミドおよび、Flp-Inシステムによって当該変異を安定的に発現可能な細胞株を樹立するために用いるプラスミドの構築を進めた。EGFR遺伝子の変異78種類、KIT遺伝子の変異43種類、NTRK1遺伝子の変異 18種類の作成を完了した。EGFRについては、複数の変異を複合的に有するプラスミドの構築も行った。
変異の機能解析にあたっては、使用する細胞株が有している野生型遺伝子の影響を排除しバックグランドを低減する必要がある。そこで、ゲノム編集によりEGFRおよびKIT遺伝子のノックアウト細胞株をHEK-293およびNIH-3T3細胞株を用いて樹立した。あわせて、下流のシグナル経路への各変異の影響を評価するLuc assayの検出感度の向上を目的に、使用するLucレポーターの変更と実験条件の最適化を行った。
EGFR変異については、ホモロジーモデリングにより各変異を構築し、定温定圧条件下における分子動力学シミュレーションを行った。使用したEGFRの立体構造モデルは、細胞外ドメインでは3QWQ.pdbを、キナーゼドメインについては3w32.pdbを使用した。MM-GBSA法により、各変異体の物理化学的および構造的変化を反映する数値情報としてギブズエネルギーを算出した。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

解析対象の変異体を培養細胞株において発現するためのプラスミドの構築法を新たに開発することで、3種類の方法を使い分けることが可能となり、ほぼ全ての変異に対応可能になっただけでなく、効率よく作ることができるようになった。機能解析に使用する細胞株が有している野生型遺伝子の影響を排除するためのノックアウト細胞株の作成法を確立するとともに、シグナル伝達経路の活性を測定するためのLucレポーターの最適化も行うことができた。EGFRについては、各変異体の物理化学的および構造的変化についての数値情報としてギブズエネルギーの算出を終了することができた。想定外であった点は、分子動力学シミュレーションを行うために導入した静岡がんセンターのサーバーシステムの運用において、オペレーティングシステムと演算を行うためのGPUの間の相性の問題が発生し、その解決に時間を要した点である。

今後の研究の推進方策

培養細胞株において変異体を発現させるためのプラスミドを構築済みの変異については、生物学的評価を着実に進めると共に、並行して進めている分子動力学シミュレーションの解析結果との相関について検討を進める。併せて検討対象とする遺伝子の拡充を進め、受容体チロシンキナーゼだけでなく、MAPキナーゼも評価対象とする。現在は変異の機能評価において関連シグナルの活性を測定することを目的としたLucレポータアッセイによる評価を主軸としているが、活性化に複合体の形成が必要な遺伝子もあるため、変異がその複合体形成に与える影響を調べることができるようにする。すでに、生物発光共鳴エネルギー転移 (BRET)によるタンパク間相互作用の解析の導入の検討を始めており、本年度中に変異の機能評価に用いることができるようにする。

次年度使用額が生じた理由

研究分担者施設における分子動力学シミュレーション用のコンピューターの導入を次年度において購入する計画に変更したため。
実験学的検討の結果と、分子動力学シミュレーションの結果の相関についての検討を次年度以降に行うため。

  • 研究成果

    (17件)

すべて 2020 2019

すべて 雑誌論文 (6件) (うち査読あり 6件、 オープンアクセス 2件) 学会発表 (11件)

  • [雑誌論文] Hypoxia Inducible Factor-1α Inhibition in Von Hippel Lindau-mutant Malignant Pleural Mesothelioma Cells.2020

    • 著者名/発表者名
      Shukuya T, Oyanagi J, Serizawa M, Watanabe M, Yamamoto N, Koh Y.
    • 雑誌名

      Anticancer Res.

      巻: 40 ページ: 1867-1874

    • DOI

      10.21873/anticanres.14140

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Assessment of associations between clinical and immune microenvironmental factors and tumor mutation burden in resected nonsmall cell lung cancer by applying machine learning to whole-slide images.2020

    • 著者名/発表者名
      Ono A, Terada Y, Kawata T, Serizawa M, Isaka M, Kawabata T, Imai T, Mori K, Muramatsu K, Hayashi I, Kenmotsu H, Ohshima K, Urakami K, Nagashima T, Kusuhara M, Akiyama Y, Sugino T, Ohde Y, Yamaguchi K, Takahashi T.
    • 雑誌名

      Cancer Med.

      巻: - ページ: -

    • DOI

      10.1002/cam4.3107

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Structural of the RAD9-RAD1-HUS1 checkpoint clamp bound to RHINO sheds light on the other side of the DNA clamp2020

    • 著者名/発表者名
      Hara K, Iida N, Tamafune R, Sakurai H, Ishikawa Y, Ohashi E, Hishiki A, Hashimoto H.
    • 雑誌名

      J. Biol. Chem.

      巻: 295 ページ: 899-904

    • DOI

      10.1074/jbc.AC119.011816

    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] Claudin-2 binding peptides, VPDSM and DSMKF, down-regulate claudin-2 expression and anticancer resistance in human lung adenocarcinoma A549 cells2020

    • 著者名/発表者名
      Nasako H, Akizuki R, Takashina Y, Ishikawa Y, Shinoda T, Shirouzu M, Asai T, Matsunaga T, Endo S, Ikari A.
    • 雑誌名

      BBA-MOL CELL RES

      巻: 1867 ページ: 118642

    • DOI

      10.1016/j.bbamcr.2019.118642

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Characterization of Tumour Mutation Burden in Patients With Non-Small Cell Lung Cancer and Interstitial Lung Disease2019

    • 著者名/発表者名
      Kobayashi H, Serizawa M, Naito T, Konno H, Kojima H, Mizuno T, Isaka M, Endo M, Nagashima T, Kusuhara M, Urakami K, Ohshima K, Yamaguchi K, Ohde Y, Takahashi T.
    • 雑誌名

      Respirology

      巻: - ページ: -

    • DOI

      10.1111/resp.13726

    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] The Pathologic and Genetic Characteristics of the Intestinal Subtype of Intraductal Papillary Neoplasms of the Bile Duct.2019

    • 著者名/発表者名
      Nakanuma Y, Kakuda Y, Fukumura Y, Sugino T, Uesaka K, Serizawa M, Terada T, Ohnishi Y.
    • 雑誌名

      Am J Surg Pathol.

      巻: 43 ページ: 1212-1220

    • DOI

      10.1097/PAS.0000000000001295

    • 査読あり
  • [学会発表] 主要8がん種における日本人と白人のがんゲノム比較解析2019

    • 著者名/発表者名
      芹澤昌邦、長嶋剛史、川端孝典、盛 啓太、釼持広知、杉野 隆、丸山宏二、大島啓一、浦上研一、秋山靖人、山口 建
    • 学会等名
      第78回 日本癌学会学術総会
  • [学会発表] オシメルチニブ耐性非小細胞肺癌細胞において活性の変化を示す代謝経路の同定2019

    • 著者名/発表者名
      梅原里奈、宮脇英里子、釼持広知、大島啓一、浦上研一、解良恭一, 高橋利明、山口 建 、芹澤昌邦
    • 学会等名
      第78回 日本癌学会学術総会
  • [学会発表] 遺伝子変異総量は非置換型肺腺癌における独立した予後規定因子である2019

    • 著者名/発表者名
      井坂光宏、芹澤昌邦、長嶋剛史、児嶋秀晃、今野隼人、水野鉄也、小野 哲、大島啓一、秋山靖人、浦上研一、遠藤正浩、杉野 隆、山口 建、高橋利明、大出泰久
    • 学会等名
      第78回 日本癌学会学術総会
  • [学会発表] 周期チェックポイントに関わる9-1-1とRHINOの相互作用解析を目的とした試料調製2019

    • 著者名/発表者名
      玉舟亮太、飯田奈央、原幸大、櫻井ひとみ、石川吉伸、大橋英治、菱木麻美、橋本博
    • 学会等名
      第17回次世代を担う若手のためのフィジカル・ファーマフォーラム
  • [学会発表] ノビレチン類似体の簡便な合成と腫瘍細胞増殖阻害活性2019

    • 著者名/発表者名
      速水勇貴、橋本博、石川吉伸
    • 学会等名
      第8回食品薬学シンポジウム
  • [学会発表] 細胞周期チェックポイントに関わる9-1-1とRHINOの相互作用解析2019

    • 著者名/発表者名
      玉舟亮太、飯田奈央、原幸大、櫻井ひとみ、石川吉伸、大橋英治、菱木麻美、橋本博
    • 学会等名
      第8回食品薬学シンポジウム
  • [学会発表] ATR-Chk1経路を担うcheckpoint clamp複合体の構造解析2019

    • 著者名/発表者名
      原幸大、飯田奈央、玉舟亮太、櫻井ひとみ、石川吉伸、大橋英治、菱木麻美、橋本博
    • 学会等名
      第25回DNA複製・組換え・修復ワークショップ
  • [学会発表] Interaction analysis between RAD9-RAD1-HUS1 heterotrimer and RHINO in ATR-CHK1 checkpoint pathway2019

    • 著者名/発表者名
      Ryota Tamafune, Nao Iida, Kodai Hara, Hitomi Sakurai, Yoshinobu Ishikawa, Eiji Ohashi, Asami Hishiki, Hiroshi Hashimoto
    • 学会等名
      第24回静岡健康・長寿学術フォーラム
  • [学会発表] 細胞周期チェックポイントに関わる9-1-1とRHINOのゲルろ過カラムを用いた相互作用解析2019

    • 著者名/発表者名
      玉舟亮太、飯田奈央、原幸大、櫻井ひとみ、石川吉伸、大橋英治、菱木麻美、橋本博
    • 学会等名
      日本病院薬剤師会東海ブロック・日本薬学会東海支部合同学術大会2019
  • [学会発表] 細胞周期チェックポイントに関わる9-1-1とRHINOの複合体のX線結晶構造2019

    • 著者名/発表者名
      飯田奈央、原幸大、櫻井ひとみ、菱木麻美、石川吉伸、橋本博
    • 学会等名
      日本結晶学会2019年度年会
  • [学会発表] DNA損傷チェックポイントの活性化を担うチェックポイントクランプ複合体の構造解析2019

    • 著者名/発表者名
      原幸大、飯田奈央、玉舟亮太、櫻井ひとみ、石川吉伸、大橋英治、菱木麻美、橋本博
    • 学会等名
      第37回染色体ワークショップ

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公開日: 2021-01-27  

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