| 研究課題/領域番号 |
19K07833
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| 研究機関 | 藤田医科大学 |
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研究代表者 |
尾身 実 藤田医科大学, 医学部, 助教 (00400416)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | 神経管 / 神経 |
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| 研究実績の概要 |
神経管閉鎖不全を含めた神経管異常は中枢神経系の先天的な発生異常であるが、それが起こる原因については不明である。発生中の神経管がバルプロ酸の作用を受けると閉鎖不全が引き起こされることが知られており、バルプロ酸の神経系に対する作用機序を解析することは、神経管形成異常の発症機構を明らかにすることに加えて、神経管の正常発生の仕組みの解明にもつながることが期待される。
本年度は、昨年度に行ったバルプロ酸の作用の解析をさらに推し進めた。マウスES細胞から胚様体を作成し、神経細胞を分化誘導した。分化誘導した神経細胞を含む細胞群をスライドチャンバーに播種したのち、培地にバルプロ酸を添加した。添加2日後もしくは3日後に免疫染色を行い、神経細胞に分化したもののみを検出した。それにより、バルプロ酸によって神経細胞の割合が減少していることを確認した。着目している遺伝子がこの現象に関与しているかを調べるため、バルプロ酸を加えた状態でshRNAによる遺伝子ノックダウンを行ったところ、神経細胞数の割合が回復していることを確認した。この際、ひとつの遺伝子に対して標的配列の異なるshRNAクローンを混合して用いるとともに、各shRNAのノックダウン効率についても調べた。さらに、着目している遺伝子を、発現ベクターを導入して強制発現をおこなったところ、バルプロ酸を加えたときのような、神経細胞数の割合が減少する傾向を示した。これらのことから、現在着目している遺伝子は、バルプロ酸によってその発現が誘導され、且つ神経細胞の減少に関わっていることが強く示唆されることとなった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
本年度は、昨年度に行ったバルプロ酸の作用について改めて検証するとともに追加の実験を行った。それにより、現在着目している遺伝子が、バルプロ酸の神経細胞数の減少に関与していることがさらに強く示唆されるに至った。一方、本実験を進める上で必要なスライドチャンバーをはじめ、細胞培養に必要な器具の入手が一時期困難な状態になったことや、代替品では細胞が生存できなかったこともあり、このような区分の判断となった。
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| 今後の研究の推進方策 |
次年度は、絞り込んで着目した遺伝子に関して、培養系神経管形成モデルを用いて、着目した遺伝子が神経管形成にどのように関与するかの解析を行う予定である。また、他の遺伝子についても発現抑制実験および過剰発現実験などにより、機能の解析を行う予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
一部の実験において次年度に引き続き解析する必要が生じたため、次年度での使用額が発生した。
研究遂行に必要なものとして、細胞および組織培養に必要な培地・血清およびプラスチック製品を計上した。また、免疫染色に必要な試薬および抗体、分子生物学実験に用いる酵素や試薬類、核酸類を計上した。また、研究を円滑に遂行するための研究補助員の人件費を計上した。成果発表および情報収集のための学会参加に掛かる費用を計上した。
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