| 研究課題/領域番号 |
19K07841
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| 研究機関 | 新潟大学 |
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研究代表者 |
清水 宏 新潟大学, 脳研究所, 准教授 (40608767)
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| 研究分担者 |
柿田 明美 新潟大学, 脳研究所, 教授 (80281012)
吉田 眞理 愛知医科大学, 付置研究所, 特命研究教授 (60288545)
宮原 弘明 愛知医科大学, 付置研究所, 講師 (00457615)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | パーキンソン病 / 組織透明化技術 / 交感神経節 / ニューロフィラメント / アルファシヌクレイン |
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| 研究実績の概要 |
近年様々な神経変性疾患の病態機序として、原因蛋白質が凝集し初期病巣を形成したのち、神経軸索を順行性または逆行性に移動し、順次神経線維をのりかえて脳・脊髄の広範な領域に拡がる蛋白質伝播仮説が提唱されている。この仮説はアルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病のいずれもが疾患独自の病変進展パターンを有する事実によく合致している。パーキンソン病ではブラークによる病変進展仮説が注目されている。この仮説では初期病変は腸管自律神経系に形成され、迷走神経を逆行性に上行して延髄に至り、脳幹から大脳辺縁系・新皮質へ進展するパターン、あるいは嗅球・扁桃体を中心に初期病巣が形成されたのちに大脳へ拡がり、同時に脳幹を下降するパターンの2つに大別される。しかしながら現実にはパーキンソン病患者の臨床症状やその出現順序は多彩であり、このパターンのどれかに当てはまるとは限らず、自律神経症状と認知症で発症するケースもしばしば見受けられる。本研究では、パーキンソン病の初期病巣は全身の様々な部位で多中心性に形成され、順次周囲組織から遠隔へ伝播する進展仮説を立て、その検証を目的とする。疾患蛋白質の伝播は、動物モデルでは詳細に検討されており、脳にアルファシヌクレインやタウを注入した場合、注入箇所を中心として、経シナプス的に脳の広範な領域へ蛋白質は伝播することが捉えられている。この動物モデルは病態の理解や治療法の開発に大きな貢献をしているが、これらの知見を臨床に応用するためにはヒトでの検証が不可欠であることから、本研究ではヒト剖検組織を透明化することにより検証する。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究ではパーキンソン病の初期病変を検討するため、その早期例、偶発例を対象とする。昨年度に引き続き疾患対象を選択した。罹病期間3年以内のパーキンソン病、臨床的にパーキンソン病を指摘されなかった複数剖検例を新たに検討した。これらの症例において嗅球・扁桃体・前頭葉・黒質・迷走神経背側核・交感神経節・食道・心臓交感神経を含むホルマリン固定パラフィン包埋切片を作製しアルファシヌクレイン免疫染色を施行したところ、複数の領域において同時にアルファシヌクレインの沈着が確認された。ブラーク仮説のとおり心臓と腸管など、末梢自律神経系のみに沈着を認めた症例がある一方、脳幹には殆どみとめられず、大脳辺縁系と末梢自律神経系のみ陽性の症例もあり、後者では空間的に離れ、直接的な線維連絡のない複数系統でアルファシヌクレインの凝集が病初期に観察されたことから、その初期病変は多中心性に形成されることが示唆された。パーキンソン病初期例および正常対照例において組織透明化による3Dイメージング技術CUBICを適応した。心臓外膜および食道はパーキンソン病初期にアルファシヌクレインが凝集しやすく、また解剖学的に自律神経を同定しやすいためCUBICの良い適応と考えられる。どちらも脂肪組織を多く含有するため、透明化のプロトコールを変更・修正し、脂肪を効率よく透明化することが可能となった。アルファシヌクレイン抗体を複数検討したがバックグラウンドが高いことが問題である。末梢自律神経にアルファシヌクレインが沈着する場合、軸索腫大をしばしば伴う。アルファシヌクレインの染色とともに、ニューロフィラメント抗体による軸索腫大の検出も平行して行っている。
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| 今後の研究の推進方策 |
パラフィン包埋切片によりアルファシヌクレイン凝集が確認された症例・部位について、ホルマリン固定組織をCUBICにより透明化し、三次元的なアルファシヌクレインの凝集・伝播を観察する。さらに抗体や染色条件の選定、光シート照明顕微鏡の観察条件の検討を進める。心臓では冠動脈前下行枝から心筋内へ交感神経が走行する。神経線維の走行が比較的明瞭であり、周囲を筋組織に包まれ自律神経系以外の神経組織の介在がないため観察に適していると考えられる。アルファシヌクレインの凝集がどのように始まるのか、すなわち交感神経線維の末端部から始まるのか否か（順行性か逆行性か）、連続的か不連続かなどを検討する。食道の自律神経も粘膜下神経叢、筋間神経叢として同定しやすいことから観察に適している。嗅球なども厚みが薄く透明化しやすい可能性があり、また神経線維も平行に走行することから、透明化や観察に適したサンプルとなり得るため検討する。
アストロサイトに凝集するアルファシヌクレインの特徴（リン酸化・非リン酸化）、アルファシヌクレイン凝集を伴う神経細胞とアストロサイトの凝集順序や細胞間の近接性なども引き続き検討する。研究計画書に則り、PDの多中心的な病巣形成との三次元的な伝播の様式、伝播おける神経細胞・グリアの関与などを順次検討する。
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