| 研究課題/領域番号 |
19K07845
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| 研究機関 | 横浜市立大学 |
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研究代表者 |
多田 美紀子 横浜市立大学, 医学部, 助教 (30722467)
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| 研究分担者 |
土井 宏 横浜市立大学, 医学部, 准教授 (10326035)
竹内 英之 横浜市立大学, 医学部, 准教授 (30362213)
田中 章景 横浜市立大学, 医学研究科, 教授 (30378012)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | ALS / Dead box RNA helicase / DDX5 / DDX17 |
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| 研究実績の概要 |
我々がポリグルタミン凝集体結合蛋白質（PAIP）として同定してきたFUS/TLS、EWS、TAF15、ubiquilin2、matrin3は、PAIPとしての重要性に留まらず、筋萎縮性側索硬化症（ALS）/前頭側頭葉変性症(FTLD)の責任遺伝子がコードするタンパク質であることが次々と判明している。このことはPAIP解析が、種々の神経変性疾患関連タンパク質の同定にも繋がる優れた方法であることを示している。本研究は、独自の凝集体精製法と質量解析を組み合わせた「凝集体プロテオーム解析」で同定したPAIPを対象に病理学的な解析を行い、我々がALS/FTLD病態関連分子候補として新規に同定したDEAD box RNA helicaseであるDDX5/17に着目したものであり、極めてオリジナリティーの高い研究である。我々は未発表PAIPのうちDDX5/17が孤発性ALS脊髄前角細胞の細胞質で異常蓄積していることを確認している。本研究では孤発性ALS連続剖検例を用いた詳細な免疫組織学的解析を行うことで、孤発性ALSにおけるDDX5/DDX17凝集の局在、特徴、重要性を明らかにする。また培養細胞（Neuro2a細胞、NSC34細胞）において、DDX5/DDX17が変性疾患病因タンパク質（ポリグルタミンタンパク、TDP-43、FUS/TLS）の凝集に与える影響を蛍光顕微鏡で観察・定量し、凝集の相互関係を検討する。NSC34細胞でTDP-43の野生型・変異型、DDX5/DDX17の過剰発現、ノックダウンを行い、マイクロアレイによってmiRNAのプロファイリングを施行することで、孤発症例でみられるmiRNA発現パターンの変化と比較検討する。また孤発性・家族性ALS患者におけるDDX5/DDX17を含めたPAIP遺伝子の変異検索を行う。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
ヒトの脊髄組織を用いた免疫組織学的解析で、DDX5陽性の神経細胞質内封入体を孤発性ALS30例中7例に認めた。形態的には類円型を呈しTDP-43陽性のround inslusionと類似しており、二重染色ではTDP-43との共局在を認めた。またTDP-43を過剰発現させたneuro2a細胞では、DDX5とTDP-43が細胞質に蓄積し、共局在することを確認した。DDX17は孤発性ALS20例全例の脊髄神経細胞の細胞質にびまん性に顆粒状の蓄積を認めており、小胞体マーカーとの共局在を認めた。TDP-43との共局在はみられなかった。また変異TDP-43を過剰発現させたneuro2a細胞ではDDX17の局在に変化はみられなかった。
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| 今後の研究の推進方策 |
DDX5/DDX17が変性疾患病因タンパク質の凝集に与える影響をみるために、細胞での解析をさらに進めていく予定である。Neuro2A細胞でDDX5/DDX17の過剰発現、ノックダウンを行い、マイクロアレイによってmiRNAのプロファイリングを施行することで、孤発症例でみられるmiRNA発現パターンの変化と比較検討する。さらには、孤発性・家族性ALS患者におけるDDX5/DDX17を含めたPAIP遺伝子の変異検索を行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
培養細胞や免疫組織学的研究のための抗体を含めた消耗品に費用をあてており、次年度も購入を続けることができるように使用額を生じさせた。次年度は抗体、試薬を各種購入する予定である。
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