| 研究課題/領域番号 |
19K07857
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| 研究機関 | 近畿大学 |
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研究代表者 |
米重 あづさ 近畿大学, 医学部, 助教 (70586750)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | 緑内障 / 細胞死 / 神経変性 |
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| 研究実績の概要 |
緑内障や水頭症において病的内圧上昇は神経変性の一因と考えられているが、汎用性や再現性の高い神経病態モデルが少ないため実験的証明が困難であり、分子機序は未だ解明されていない。本研究は緑内障における眼圧上昇と網膜神経節細胞変性との因果関係を明確にし、その病態形成の分子基盤を解析することを目的としている。方法として研究代表者らが独自に開発した細胞培養加圧装置を用いて圧上昇と神経節細胞変性との相関解析を行っている。加圧装置を用いた高眼圧性緑内障の実験モデル構築においては、網膜組織培養系が有用であることを既に見出している。この系を用いて高眼圧状態を再現し、神経傷害因子の発現上昇及び神経節細胞死率の上昇を明らかにした。また、これらの変化が高眼圧性緑内障モデルマウスの網膜でも起こっていることを確認し、本培養モデルは生体をよく模倣していると分かった。現在、圧上昇に伴って高発現する遺伝子と神経細胞死との直接的な因果関係を検証中である。
内圧の上昇は種々の疾患の原因であるが、圧力負荷による細胞・組織変性の機序はほとんど明らかでない。特に緑内障や水頭症においては、眼圧または頭蓋内圧の軽減がほぼ唯一効果的な治療法であるにもかかわらず、内圧上昇と神経変性との直接的因果関係でさえ議論中である。今年度の成果により、眼圧上昇と網膜神経節細胞死との因果関係は明確になりつつある。今後は、網膜組織水柱下培養系および高眼圧性緑内障モデルマウスを用いて、同定された神経傷害因子の機能阻害剤の網膜神経節細胞保護の効果判定を行う予定であり、将来的には分子機序に基づいた新たな緑内障治療法開発へと発展する可能性がある。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
Ａ．静的圧力上昇に対する網膜神経節細胞死・軸索変性の分子基盤の解明
はじめに、本研究課題の根幹を成す水柱下培養系の構築を行った。既報文献を参考にして網膜組織培養、網膜由来初代神経細胞培養、網膜由来不死化神経細胞株の３系統を予備実験に供した。各系統において、組織採取法や培養条件などの検討を行った結果、網膜組織培養の系が本研究課題の達成において最適であると判断した。初代神経細胞培養や不死化神経細胞株も水柱下培養の実施は可能であったが、細胞の分化状態の維持が困難であったため更なる検討は行わなかった。網膜組織培養において2-50cm水柱条件下で２日間培養したところ、高圧負荷によって神経傷害タンパク質の発現が上昇していた。また、TUNEL法によりアポトーシス細胞を観察したところ、高圧条件下では網膜神経節細胞層で陽性細胞が増加していた。一方で、神経傷害タンパク質の機能阻害薬を添加して網膜組織培養を同様に行ったところ、アポトーシス陽性率が減少した。以上のことから、高圧負荷によって網膜組織中で神経傷害因子の発現が誘導され、その結果アポトーシスが惹起されていることが示唆された。現在、この傷害因子が直接的に網膜神経細胞死を誘導するか検証している。
B．高眼圧性緑内障モデルマウスでの実態解析
DBA/2Jマウスは眼房水の排出障害による高眼圧性緑内障モデルで、6-12ヶ月齢で眼圧が上昇する。手持ち眼圧計でDBA/2Jマウスの眼圧を経時的に測定したところ、既報のとおり9ヶ月齢がピークであった。3-12ヶ月齢の網膜を採取し、上記Aで同定された神経傷害因子のタンパク質発現を調べたところ、9-12ヶ月齢の網膜で発現上昇が確認された。現在、免疫組織学的解析により、神経傷害因子発現とアポトーシス陽性細胞との局在解析を行っている。
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| 今後の研究の推進方策 |
現在明らかになりつつある、高圧負荷による神経傷害因子の発現誘導と細胞死惹起に関しては、不死化網膜神経細胞株を用いて、傷害因子の投与によって細胞死が誘導されるか検討中である。また、水柱下培養実験によって、この傷害因子の機能阻害薬が高圧負荷による細胞死を減弱させることが分かったので、不死化網膜神経細胞株を用いた系でも同様に効果があるか検証すると同時に、高眼圧性緑内障モデルDBA/2Jマウスに３ヶ月齢から投与し、生体でも網膜保護効果があるか検証する。また、この傷害因子については、緑内障だけでなく様々な神経変性疾患においても発現上昇が認められているが、この因子が関わる細胞死誘導機構は未知である。将来的には機械的ストレス応答機構の解明も含め、より詳細な分子機序の探索が必要となるであろう。本項目の研究成果については、現行の実験的検証が完了次第、専門誌への論文投稿を行う。
以上のように本研究課題は、静的圧力上昇に対する網膜神経節細胞死の分子基盤研究に関しては順調に進捗しほぼ完了間近であるが、静的圧力上昇に対する網膜軸索変性の分子基盤研究に関しては今後重点的に推進していく予定である。網膜軸索変性においては、研究代表者らの先行研究により着想した神経接着分子の細胞内断端のタンパク質構造異常による軸索変性という仮説を検証する。神経接着分子の細胞内断端の配列のうち構造異常が起きやすいと予想される部位の策定は完了しており、共同研究の確立および予備実験の準備状況は順調であり、今後速やかに実施される予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本研究の実施に必要な実験備品および備品消耗品が、研究代表者の所属研究室の備品等が使用可能であったことと、所属大学から付与される研究費で一部研究費を並行運用できたため、次年度使用額が生じた。次年度使用額については、研究計画に則り今後も使用予定であるが、必要に応じてより高性能な物品の購入など、研究を効率的に推進するために適正に使用する。
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