| 研究課題/領域番号 |
19K07861
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| 研究機関 | 北海道大学 |
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研究代表者 |
惠 淑萍 北海道大学, 保健科学研究院, 教授 (90337030)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | Keap1-Nrf2 / 酸化 / カルジオリピン / コレステリルエステル |
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| 研究実績の概要 |
糖尿病性腎症は活性酸素種が極めて重要な役割を果たすことが知られている。本研究課題は、糖尿病性腎症を、近位尿細管細胞への脂肪酸流入とコレステリルエステル（ＣＥ）蓄積を発端に始まり、ミトコンドリアを巻き込んで進行する酸化的悪性サイクルとして理解し、それを制御する手段を提案することを目的とする。令和2年度は、１）ミトコンドリア内膜特異的なカルジオリピン（CL）のLC/MS分析法を構築する、２）細胞中のCLを分析しＣＥ酸化やＣＬ減少との関係を観察する、ことを目標にした。下記に令和２年度の研究成果と今後の方針について記す。
令和２年度はまず、自家合成のCLを内標準物質に、高分解能質量分析装置であるOrbitrapを用いて半定量的CL分析法を構築した。その分析法をHK-2細胞（健常成人腎臓由来の近位尿細管上皮細胞株）のCL測定に応用したところ、CLを33分子種検出した。コントロール群では分子種CL70:4とCL72:5が多く検出された。各脂肪酸を負荷したところ，CLではコントロールと比較して減少傾向にある分子種も多く見られた。各CL 分子種の総和を脂肪酸添加群ごとに比較したところ，コントロールと比較して不飽和脂肪酸添加群において減少が見られた。また、CLの過酸化物であるCL-OOHの分布を確認した。CL-OOH72:4，72:6，72:8の3分子種が検出された。FA18:1，18:2，20:4を添加した際にCL-OOHの有意な増加が見られた。
なお、HK-2細胞の各脂肪酸添加群におけるCEとCL分子種の総和の関連についても検討した。総CEと総CLの間に負の相関が見られたが，有意ではなかった。令和3年度では腎臓病発症を新規Keap1-Nrf2経路活性化物質による制御を検討していく。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
令和2年度は、ミトコンドリア内膜特異的なカルジオリピン（CL）のLC/MS分析法を構築し、細胞中のCLを分析した。また、コレステリルエステル（CE)の酸化やＣＬ減少との関係を観察した。
当ラボではCLのＬＣ／ＭＳ分析法の確立に必要なCL標準物質及び市販されていなく入手困難なCLの内標準物質に関する化学合成法がすでに確立できたため、標準物質および内標準物質をすべて化学合成により取り揃えた。それらを用いて高感度かつ特異性のあるCLのＬＣ／ＭＳ半定量法が確立できた。
当研究室ではコレステリルエステルのＬＣ／ＭＳ分析法が既に確立されており、細胞中のCEも定量することができた。以上により、本研究課題が概ね順調に進展している。
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| 今後の研究の推進方策 |
研究代表者の研究チームは肝細胞の脂肪蓄積と酸化を抑制できる、安全性と有効性の面でも優れているKeap1-Nrf2経路活性化物質を食品・天然物から見いだした。
糖尿病性腎症は脂肪蓄積と酸化が重要な役割を果たすことが知られている。肝細胞の脂肪蓄積と酸化を抑制できる機能性物質探索の経験を活かし、今後は腎臓由来の近位尿細管上皮細胞（HK-2）を用いて、腎臓病発症を新規Keap1-Nrf2経路活性化物質による制御を検討していく。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
１．腎臓由来の近位尿細管上皮細胞培養実験のために、細胞、培地、血清、プラスチック製品が必要である。
２．カルジオリピン（CL）やコレステリルエステルや他の脂質の質量分析のために有機溶媒と質量分析計の校正スタンダードおよびカラムなどを購入する必要がある。
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