| 研究課題/領域番号 |
19K07899
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| 研究機関 | 東京慈恵会医科大学 |
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研究代表者 |
高田 耕司 東京慈恵会医科大学, 医学部, 教授 (30179452)
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| 研究分担者 |
松浦 知和 東京慈恵会医科大学, 医学部, 教授 (30199749)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | ユビキチン / ポリユビキチン鎖 / プロテオスタシス / 老化 / 細胞老化 / 正常二倍体細胞 / 加齢性疾患 |
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| 研究実績の概要 |
真核生物の細胞内タンパク質は、遺伝子発現による合成とプロテアソーム系やオートファジー系による分解により、その量・質が適正に保たれる。これがタンパク質の恒常性（プロテオスタシス）である。近年、老化に伴う両分解系の機能不全が加齢性疾患のリスク要因になると指摘されている。本研究では両系の分解シグナルであるポリユビキチン鎖に着目し、プロテオスタシスに基づく老化マーカーとしての意義を検討する。新規試薬を用いてポリユビキチン鎖を認識するFK2抗体を固相化抗体と酵素標識抗体に用いたFK2-FK2 ELISAの鎖型特異性を検討したところ、この測定系は3種類のポリユビキチン鎖各型（K48鎖型，K64鎖型，M1鎖型）をほぼ同等に認識し、全鎖総量の測定に適することを再確認した。続いて、各鎖型に特異的な測定系を構築するため、酵素標識抗体を市販の抗K48鎖抗体および抗K63鎖型抗体に変更したサンドイッチELISAの構築を試みた。その結果、前者（FK2-抗K48鎖 ELISA）は、K48鎖（～100 ng/ml）との交差反応性を示さなかった。また、後者（FK2-抗K63鎖 ELISA）はK63鎖（20 ng/ml～）を検出したものの、その検出感度はFK2-FK2 ELISAよりも20倍以上低く、検討した市販抗体は不適格と判明した。次に、約20 PDL（細胞集団倍加数）のヒト正常二倍体線維芽細胞TIG-1を8～16 PDLの間隔で回収しながら、クライシス（72 PDL～）まで継代培養し、1% Triton X-100可溶性の易溶性画分とその不溶成分を2% SDSで抽出した難溶性画分に含まれるポリユビキチン鎖を定量した。その結果、非老化細胞群（24～56 PDL）と老化細胞群（64～72 PDL）の各画分間の比較でポリユビキチン鎖量の有意差を認めなかったため、その背景を探索するための実験を継続している。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
初年度はメチル基転移酵素SETD8阻害による細胞老化モデル実験系を用いて細胞内ポリユビキチン鎖の定量解析の問題点を解決し、基盤となる実験手技の標準作業手順を確立した。しかし、その後、新型コロナウイルス感染症（COVID-19）への対応に伴う教育・入試等の責務の急激な増加により、研究活動の停止を余儀なくされ、2020年度の進捗に関して記載し得る事項はない。2021年度もCOVID-19以前ほどの研究時間を確保できない状況であるが、懸案としていた２つの重要課題、「ポリユビキチン鎖各型に特異的なELISAの構築」と「ヒト正常二倍体線維芽細胞の継代培養による細胞老化実験系」に取り組み、各課題に対する明確な結論を得た。この他、「温熱・寒冷曝露に伴う細胞内ポリユビキチン鎖量の変動」や「エクソソーム（細胞外顆粒）のポリユビキチン鎖含有量」などに関する予備的な結果を得ており、進捗の遅れを徐々に取り戻しつつある。
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| 今後の研究の推進方策 |
COVID-19による研究環境の変化により、当初計画していたすべての目標を残り1年間で達成することは困難な状況である。しかし、加齢性疾患の病態解析に向けた「ポリユビキチン鎖定量解析の将来性」を推し量るための方策として、次の４課題について以下の優先順位を設定する。
最優先とする「課題１：ヒト正常二倍体線維芽細胞TIG-1を用いた細胞老化実験」では、温熱等のストレス負荷後の非老化細胞と老化細胞のポリユビキチン鎖量の変動を比較解析し、細胞老化に伴うプロテオスタシスの変化を明確にする。次に優先する「課題２：エクソソーム含有ポリユビキチン鎖の定量解析」では、細胞内外のポリユビキチン鎖の量的関係を解明することで分析すべき臨床検体の種類を絞り込む。以上の課題の成果にもとづいて、最終段階の「課題３：老化促進モデルマウスの組織・体液のポリユビキチン鎖定量解析」および「課題４：ヒト由来の各種検体（血液、爪、毛髪等）のポリユビキチン鎖定量解析」の具体的な分析対象を絞り込む。なお、課題３は動物実験委員会、課題４は倫理委員会の承認が必要であり、サンプルの収集に一定の時間を要するため、課題１および課題２の実験と並行して準備に取り掛かる計画である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
新型コロナウイルス感染症（COVID-19）への対応に伴う教育・入試等の責務の急激な増加により、2020年度は研究活動の停止を余儀なくされ、2021年度以降もCOVID-19以前ほどの研究時間を確保できない状況が継続している。そのため、予定していた実験動物と各種物品の購入を延期せざる得なくなり、それらの経費を次年度に持ち越すこととなった。具体的には、老化促進モデルマウス、細胞培養およびELISA関連の試薬などとともに、データの解析と保存に使用するパソコン、スキャナーおよびソフトウェアの購入を予定している。無菌操作に必要なクリーンベンチの附属消耗品「へパフィルター」は徐々に劣化しているものの、最低限の性能を維持しているため、定期的モニタリングを続けて交換時期を見定めたい。
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