| 研究課題/領域番号 |
19K07979
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| 研究機関 | 北里大学 |
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研究代表者 |
永井 真貴子 北里大学, 医学部, 講師 (80420488)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | 筋萎縮性側索硬化症 / 前頭側頭型認知症 / 海馬 / アデノ随伴ウィルス |
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| 研究実績の概要 |
認知症を伴う筋萎縮性側索硬化症（ALS）患者の剖検脳を用いた解析では，リン酸化TDP-43タンパクの凝集が嗅内皮質・海馬歯状回・CA3/CA1に認められる。本研究ではアデノ随伴ウィルス（AAV）を用いてALS関連異常蛋白をマウス海馬及び関連部位に発現させることで神経細胞死の伝播を再現したモデルを作成し，その機序について解明することが目的である。
2019年度は，緑色蛍光蛋白（GFP）cDNAを組み込んだAAV(AAV-GFP)を海馬および海馬に関連する部位に注入し，その発現の解析を行った。海馬はCA1, CA3, 歯状回の各細胞群と入力・出力部位がある程度同定されており，入力は嗅内皮質（第2層），内側中隔野で，出力先は嗅内皮質（第5層）とされる。AAV-GFPをマウスの海馬および嗅内皮質，内側中隔野の各部位に注入し，2週間後にホルムアルデヒド液で還流固定し凍結切片を作成，抗GFP抗体を用いて免疫染色して，注入部位のGFP発現細胞群，GFPを発現した神経線維の投射先を確認した。
TDP-43は正常では核に存在するタンパクで414アミノ酸からなり，N末に核外移行シグナル，中央にRNA結合部位，C末にタンパク結合部位がある。ALS患者脳ではTDP-43が核外に移動し，不溶化・リン酸化する。遺伝性ALS患者ではC末に遺伝子変異が多く認められる。そこで正常TDP-43 cDNAと3種類の変異型TDP-43 cDNA（遺伝性ALS患者由来の変異を導入したTDP-43，N末（核外移行シグナル）あるいはC末を除去した変異型TDP-43）を組み込んだ計4種類のAAVベクター（AAV-TDP-43）を作成した。2020年度は作成した4種類のAAV-TDP-43を海馬および嗅内皮質，内側中隔野の各部位に注入し，行動解析・病理学的解析・タンパクの解析を行う予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
2019年度は，(1) 緑色蛍光蛋白（GFP）cDNAを組み込んだAAV(AAV-GFP)を海馬および海馬に関連する部位に注入し，その発現の解析を行った。AAV-GFPを脳定位固定装置を用いてマウス海馬（CA1, CA3, 歯状回）と入力部位である嗅内皮質，内側中隔野に注入した。大脳切片免疫染色を用いて，注入部位のGFP発現細胞群，GFPを発現した神経線維の投射先を確認することができた。
(2) 正常及び3種類の変異型TDP-43cDNAを組み込んだAAVベクターを作成した。正常TDP-43cDNAを用いて遺伝性ALS患者由来の変異を導入したTDP-43cDNA，N末（核外移行シグナル）あるいはC末を除去した変異型TDP-43cDNAを作成した。作成したTDP-43cDNAは発現ベクターを用いてマウス神経芽腫由来培養細胞であるNeuro2aに強制発現させ，細胞内分布・リン酸化について解析した。さらに正常および3種の変異型TDP-43cDNAを組み込んだAAVベクターを作成し，2020年度にマウスに注入する準備ができた。
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| 今後の研究の推進方策 |
AAV-GFPを注入したマウス脳の解析では，今回用いたAAVベクターによるGFPの発現解析により，海馬の細胞群および嗅内皮質・内側中隔野から海馬に神経線維が投射していることが確認できた。このため同じAAVベクターを用いれば，海馬の細胞群および海馬に投射する神経に目的のタンパクの発現が期待される。2020年度は，作成した正常および3種類の変異型TDP-43cDNAを組み込んだAAVをマウス大脳の海馬歯状回・嗅内皮質・内側中隔野の各部位に注入し，マウスの行動解析を行う。また行動解析後のマウスはホルムアルデヒド液で還流固定して大脳切片を作成し，免疫染色を用いて病変の広がりや神経細胞内の核・細胞質などの分布について解析する。別に行動解析後のマウスの海馬や嗅内皮質を未固定で摘出し，TDP-43タンパクのリン酸化などについてウェスタンブロット法を用いて解析する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
マウスの行動解析を行う機器を予算に申請していたが，2019年度は主にAAV-GFPを用いた解析だったため，マウスの行動解析を行うことがなかった。2020度にAAV-TDP43マウスを作成時に購入を予定している。
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