| 研究課題/領域番号 |
19K07979
|
|---|
| 研究機関 | 北里大学 |
|---|
研究代表者 |
永井 真貴子 北里大学, 医学部, 講師 (80420488)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
|
| キーワード | 筋萎縮性側索硬化症 / 海馬 / アデノ随伴ウィルス / TDP-43 |
|---|
| 研究実績の概要 |
認知症を伴う筋萎縮性側索硬化症（ALS）患者の剖検脳を用いた解析では，リン酸化TDP-43タンパクの凝集が嗅内皮質・海馬歯状回・CA3/CA1に認められる。本研究ではアデノ随伴ウィルス（AAV）を用いてALS関連異常蛋白をマウス海馬及び関連部位に発現させることで神経細胞死の伝播を再現したモデルを作成し，その機序について解明することが目的である。TDP-43は正常では核に存在するRNA結合タンパクでRNA輸送や転写の調節に関与している。ALS患者神経細胞の細胞質に凝集するリン酸化されたTDP-43は切断されたC末端断片であることが分かっている。
2019年度は緑色蛍光蛋白（GFP）cDNAを組み込んだAAV(AAV-GFP)を海馬および海馬に関連する部位（海馬CA1/CA3, 歯状回，嗅内皮質，内側中隔野）に注入して，注入部位のGFP発現細胞群，GFPを発現した神経線維の投射先の解析を行った。GFPは注入部位の神経細胞の主に細胞質と軸索に発現し，嗅内皮質と内側中隔野のGFPは海馬に投射することが確認された。
2020年度は正常TDP-43cDNA (TDP-43W)とALS患者由来のA315T変異を導入したTDP-43cDNA (TDP-43A)とC末断片(TDP-43C)をAAVベクターに組み入れ，海馬CA1/CA3，嗅内皮質に注入し，大脳凍結切片を抗FLAG抗体で免疫染色することによりTDP-43蛋白発現の解析を行った。TDP-43W，TDP-43A蛋白は注入部位の神経細胞の核に発現し，経過ともに神経細胞が変性した。TDP-43Cは細胞質に分布し軸索の近位部まで発現を追うことができた。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
2019年度は，緑色蛍光蛋白（GFP）cDNAを組み込んだAAV(AAV-GFP)を海馬および海馬に関連する部位に注入し，その発現の解析を行った。
2020年度は正常TDP-43cDNA (TDP-43W)とALS患者由来のA315T変異を導入したTDP-43cDNA (TDP-43A)とC末断片(TDP-43C)をAAVベクターに組み入れ，海馬CA1/CA3，嗅内皮質に注入し，TDP-43蛋白発現の解析を行った。
TDP-43蛋白による病理学的な評価はできたが、注入部位の蛋白の解析、投射先の神経細胞の解析ができなかった。
|
| 今後の研究の推進方策 |
AAVによるTDP-43蛋白の過剰発現により海馬関連細胞の神経細胞死が得られたが、その投射先の細胞の解析が困難であった。AAV-GFPを注入したマウス脳の解析では，GFPの発現により神経細胞の軸索の可視化することが容易であった。2021年度は，AAV-TDP-43とAAV-GFPを同時に注入することにより，注入部位神経細胞の投射先の細胞を同定して病理学的解析・タンパクの解析を行い、またマウスの行動解析を行う予定である。
|
| 次年度使用額が生じた理由 |
2019年度に行動解析を行うための機器の購入を予定していたが、2019年度・2020年度とも病理学的解析が主であった。2021年度は行動解析を予定しており購入を予定している。
|
