| 研究課題/領域番号 |
19K07981
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| 研究機関 | 帝京大学 |
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研究代表者 |
斉藤 史明 帝京大学, 医学部, 准教授 (40286993)
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| 研究分担者 |
真先 敏弘 帝京科学大学, 医学教育センター, 教授 (00585028)
萩原 宏毅 帝京科学大学, 医療科学部, 教授 (80276732)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | 筋強直性ジストロフィー / アルツハイマー型認知症 / ゲノム編集 / CRISPR/Cas9 |
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| 研究実績の概要 |
これまで原因が不明とされてきた神経変性疾患や遺伝性筋疾患の多くでその病態や遺伝子異常の詳細が明らかにされつつある。例えばアルツハイマー病においてはアミロイド前駆体蛋白質からアミロイドβが切り出され毒性を有する可溶性オリゴマーが形成される。また筋強直性ジストロフィーをはじめとするリピート病では、異常伸長した３塩基リピート配列が凝集体を形成しこれが細胞に対して毒性を発揮する。これらペプチドや核酸の“凝集病“においてはこの凝集を制御することが疾患治療にむけての明確な分子標的となる。近年CRISPR/Cas9によるゲノム編集技術が急速なスピードで進歩を遂げ、医学・生物学分野の研究や疾患治療への応用が期待されている。本研究の目的はCRISPR/Cas9とそれに関連したゲノム編集技術を用いて、これら難治性神経筋疾患に対する新規治療法開発のための基礎的研究を行う事である。
本年度は筋強直性ジストロフィーに対してCRISPR/Cas9の基本的な技術であるCas9 nucleaseを用いた方法と、非特異的なゲノムの切断であるoff-target効果の低減が期待されるCas9 nickaseを用いたダブルニッキング法を用いて、患者由来の線維芽細胞におけるCTGリピート配列の除去に関する検討を行った。その結果両者の方法においてCTGリピートを除去することが可能であることがPCR方、サンガーシーケンス法により確認された。また核内におけるリピート配列の凝集体形成をRNA-FISH法により観察したところ、いずれの方法においても凝集体形成が著しく抑制されることが明らかになった。さらに両者のoff-target効果をhigh-throughput genome-wide translocation sequence法を用いて検討したが、予想に反して同程度の非特異的切断を認めた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
通常のCas9 nucleaseを用いる方法とダブルニッキング法の比較検討を行うことができた。この結果ダブルニッキング法ではoff-target効果の低減が期待されたものの、その優位性を示すことはできなかった。本年度はさらにCRISPR interference法によるリピート配列を含むDMPK遺伝子の転写抑制や筋強直性ジストロフィーのモデルマウス作製を開始する予定であったがそこまでは進まなかった。これらのことからやや遅れていると自己評価した。
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| 今後の研究の推進方策 |
次年度は上述したCRISPR interference法によりリピート配列の転写を抑制することによって凝集体形成を抑制することが可能かどうかを観察すると共に、in vivoの系を用いて凝集体の形成抑制効果を検討するために筋強直性ジストロフィーのモデルマウス作製を行う。さらにCRISPR/Cas9によりアミロイド前駆体蛋白質やその切断酵素をノックダウンして、アミロイドβの切り出しを制御することができるかどうかの研究も開始する予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本年度の後半には本研究の成果発表のための論文執筆を行ったため、予定していた筋強直性ジストロフィーのモデルマウス作製を実施できなかった。次年度使用分に回った金額はこのための金額である。翌年度分はこのモデルマウスの作製並びに予定されていたアルツハイマー型認知症など他の疾患に対するゲノム編集を用いた治療法開発に関わる基礎的研究に使用する予定である。
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