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2020 年度 実施状況報告書

脊髄小脳変性症モデルマウスを用いたCRISPR/Cas13による新しい核酸医療

研究課題

研究課題/領域番号 19K07994
研究機関広島大学

研究代表者

松田 由喜子  広島大学, 原爆放射線医科学研究所, 研究員 (10735301)

研究期間 (年度) 2019-04-01 – 2022-03-31
キーワード脊髄小脳変性症
研究実績の概要

優性遺伝生脊髄小脳変性症(SCD)は小脳性運動失調を主症状とする神経変性疾患であり、これまで原因遺伝子が30個以上同定されている。個々の病態も徐々に明らかにされてきたが、低分子医薬品の開発まで至っておらず治療法は未だ対症療法中心である。一方、近年注目されているのが、核酸医薬による分子標的治療であり、SCDのうちリピート病においてオリゴヌクレオチド(ASO)による治療法の開発が進んでいる。しかし、点変異による病型に関してはより特異性の高い新しい核酸医療の開発が必要とされる。
申請者らは、T型Caチャネル(CACNA1G)の点変異がSCDの原因遺伝子であることを見出し(病型:SCA42)、CRISPR/Cas9システムを用いてノックアウトマウスを作製した。このマウスはヒトと同様緩徐な進行性の運動失調症状を示した。SCA42型ノックインマウスを用い、一塩基変異を高感度かつ正確に認識しRNase活性を持つCRISPR/Cas13dシステムにより、点変異型SCDに対する新しい核酸医療を開発することが本研究の目的である。
令和2年度においては、野生型及びノックインマウスの小脳の初代培養系を確立し、昨年度確立したCRISPR/Cas13dシステムに用いるAAV2ベクターの構築及びウイルス作製の系を用いて、プルキンエ細胞特異的にCRISPR/Cas13dを発現するAAV2ウィルスを感染させた。感染の時期、量、効果が見られ始める時期の条件を検討した。現在、ガイドRNAのターゲット遺伝子の転写産物に対する特異性を検討している。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

マウスの小脳初代培養及びAAV2ウィルスの作製に時間がかかり、ガイドRNAの最適化の検討に時間がかかっているため。

今後の研究の推進方策

CRISPR/Cas13dのガイドRNAの最適化の検討を続行するが、変異型mRNAのみに対する特異性が難しい場合、mRNAのノックダウンではなく点変異を正常化編集するCRISPR/Casに変更することも検討する。

次年度使用額が生じた理由

当初の研究計画よりやや遅れを生じており、変異型に特異的なガイドRNAの選定に時間がかかっている。令和2年度に計画していた実験を引き続き令和3年度の実験計画に合わせて行う。ガイドRNAを新たに設計し、ウイルスを作製するために使用する細胞への遺伝子導入試薬と精製用カラムに約40万円使用する。作製したガイドRNAの選定のためのノックインマウス小脳初代培養実験において使用するマウスおよび培養試薬、RNA抽出試薬、RT-qPCR用試薬に約40万円を使用する計画である。

  • 研究成果

    (5件)

すべて 2021 2020

すべて 雑誌論文 (4件) (うち査読あり 4件、 オープンアクセス 2件) 学会発表 (1件)

  • [雑誌論文] Kv11 (ether-a-go-go-related gene) voltage-dependent K + channels promote resonance and oscillation of subthreshold membrane potentials2021

    • 著者名/発表者名
      Matsuoka Toshinori, Yamasaki Miwako, Abe Manabu, Matsuda Yukiko, Morino Hiroyuki, Kawakami Hideshi, Sakimura Kenji, Watanabe Masahiko, Hashimoto Kouichi
    • 雑誌名

      The Journal of Physiology

      巻: 599(2) ページ: 547-569

    • DOI

      10.1113/JP280342

    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] Zonisamide can ameliorate the voltage-dependence alteration of the T-type calcium channel Cav3.1 caused by a mutation responsible for spinocerebellar ataxia2020

    • 著者名/発表者名
      Hara Naoyuki, Morino Hiroyuki, Matsuda Yukiko, Satoh Kenichi, Hashimoto Kouichi, Maruyama Hirofumi, Kawakami Hideshi
    • 雑誌名

      Molecular Brain

      巻: 13(1) ページ: 163-169

    • DOI

      10.1186/s13041-020-00700-7

    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] The first Japanese case of primary familial brain calcification caused by an MYORG variant2020

    • 著者名/発表者名
      Kume Kodai, Takata Tadayuki, Morino Hiroyuki, Matsuda Yukiko, Ohsawa Ryosuke, Tada Yui, Kurashige Takashi, Kawakami Hideshi
    • 雑誌名

      Journal of Human Genetics

      巻: 65(10) ページ: 917-920

    • DOI

      10.1038/s10038-020-0779-x

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Aggressive periodontitis and NOD2 variants2020

    • 著者名/発表者名
      Mizuno Noriyoshi, Kume Kodai, Nagatani Yukiko, Matsuda Shinji, Iwata Tomoyuki, Ouhara Kazuhisa, Kajiya Mikihito, Takeda Katsuhiro, Matsuda Yukiko, Tada Yui, Ohsawa Ryosuke, Morino Hiroyuki, Mihara Keichiro, Fujita Tsuyoshi, Kawaguchi Hiroyuki, Shiba Hideki, Kawakami Hideshi, Kurihara Hidemi
    • 雑誌名

      Journal of Human Genetics

      巻: 65(10) ページ: 841-846

    • DOI

      10.1038/s10038-020-0777-z

    • 査読あり
  • [学会発表] Biochemical analysis of middle-age-onset SCAR caused by a biallelic mutation of HSD17B42020

    • 著者名/発表者名
      Matsuda Y, Morino H, Kurashige T, Miyamoto R, Maruyama H, Kawakami H
    • 学会等名
      第61回日本神経学会学術大会

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公開日: 2021-12-27  

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