| 研究課題/領域番号 |
19K08087
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| 研究機関 | 地方独立行政法人大阪府立病院機構大阪急性期・総合医療センター(臨床研究支援センター) |
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研究代表者 |
松永 秀典 地方独立行政法人大阪府立病院機構大阪急性期・総合医療センター(臨床研究支援センター), 精神科, 主任部長 (70603843)
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| 研究分担者 |
福森 亮雄 国立研究開発法人国立長寿医療研究センター, 認知症先進医療開発センター, 室長 (00788185)
多田 敬典 国立研究開発法人国立長寿医療研究センター, 統合加齢神経科学研究部, 室長 (20464993)
田中 惠子 新潟大学, 脳研究所, 非常勤講師 (30217020)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | 抗NMDA受容体抗体 / ウサギ網赤血球系蛋白合成システム / 膜蛋白 / ラジオリガンドアッセイ |
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| 研究実績の概要 |
これまで研究責任者は、ボルナウイルスのRI標識抗原の作成をウサギ網赤血球ライセート由来の蛋白合成システムを用いて行い良好な結果を得ている。抗NMDA受容体抗体の抗原であるNMDA受容体は3種のサブユニットで構成される4量体で、それぞれのサブユニットが大きく（ボルナウイルスの抗原は23kDaと40kDa、NMDA受容体は103kD、163kDa、163kDa）、受容体が膜上に発現するという違いがある。
まず、ウサギ網赤血球系の蛋白合成システムの反応液に膜成分を追加し、２種のサブユニットを同時に合成した（3種ともではなく2種でも受容体ができる見込み）。その後、膜に発現しているであろう受容体を、立体構造を崩さずに1つ1つに分ける目的でDDM(n-Dodecyl-β-D-maltoside)を加えた。電気泳動により、上記のサブユニットの分子量のタンパクを確認した（ただし少量）。この抗原溶液を血清と反応させた。血清には、共同研究者である田中より供与された抗MMDAR抗体陽性・陰性あわせて35検体のうち数検体をブラインドで、および、研究責任者が所属する病院で治療された抗NMDAR抗体脳炎やそれ以外の陰性検体を使用した。測定結果は、いずれも比較的低いRI活性を示し、DDMの濃度、ブロッキング剤の変更（BSAからiblockへ）を試みたが、陽性検体と陰性検体とを明確に区別することが困難であった。不成功の理由として、大きな蛋白であるため収量が少ないことや、膜上にできていない可能性等が考えられた。
次の方策として、蛋白の収量が多く、膜蛋白を膜上に発現させることが可能とされているコムギ胚芽由来の蛋白合成システムを用いて、蛋白合成を試みる方針にしており、プラスミドを作成中である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
自己抗体の測定に必要な、立体構造を保ったRI標識抗原の作成にまだ成功していない。
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| 今後の研究の推進方策 |
引き続きウサギ網赤血球系の蛋白合成システムで適切な抗原の作成を試みるが、小麦胚芽由来の蛋白合成システムを用いて蛋白の合成を行うべく、プラスミドを作成中である。この方法を用いて、収量を増やすとともに、膜上に立体構造を保った受容体の作成を目指す。
複数のサブユニットからなる4量体の膜蛋白であるNMDA受容体の作成が難しい場合は、単一の蛋白であるドーパミンD2受容体やセロトニン1A受容体など、より単純な構造の膜蛋白の作成、およびそれに対する自己抗体の測定を試みる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
研究分担者に関しては、既存の物品で対応できたため。
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