遅発性活性酸素種抑制による正常細胞の防護

2019 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 19K08150
• 研究機関: 奈良県立医科大学
• 研究代表者: 小橋川 新子 (菓子野新子) 奈良県立医科大学, 医学部, 特別研究員 (70637628)
• 研究分担者: 菓子野 元郎 奈良県立医科大学, 医学部, 准教授 (00437287) ; 森 英一朗 奈良県立医科大学, 医学部, 准教授 (70803659)
• 研究期間 (年度): 2019-04-01 – 2023-03-31
• キーワード: 遅発性活性酸素種 / ミトコンドリア / 電離放射線 / 細胞老化 / アスコルビン酸誘導体 / SASP

研究実績の概要

本研究ではまず放射線照射による遅発性活性酸素種の産生が正常細胞とがん細胞とで異なるのか、正常ヒト胎児由来細胞と口腔癌細胞を用いて検討し、さらに抗酸化剤を用いて遅発性活性酸素種を抑制することで正常細胞を防護でき得るか細胞増殖、細胞老化、DNA 損傷数で比較検討することを予定していた。まず正常ヒト線維芽細胞においては放射線照射によって遅発性活性酸素種が産生され、これは抗酸化剤であるアスコルビン酸誘導体（AA-2G）の処理により部分的に抑制できることがわかった。細胞外フラックスアナライザーを用いてミトコンドリア機能を測定した結果、照射により基底状態及び最高呼吸能が増加していることがわかった。このことが照射後のミトコンドリア由来遅発性活性酸素種を増加させる要因となっていることが示唆された。老化関連タンパク質の発現を調べた結果、正常ヒト細胞（BJ-ｈTERT細胞）では放射線照射30分～4時間後まではDNA損傷を起因としてATM、p53が活性化するため抗酸化剤を処理してもこれらのタンパク質のリン酸化状態や発現量に変化は無かった。驚くべきことに、放射線照射6時間～7日後までのATM、p53、p21の発現は遅発性活性酸素種によって制御されており、この間に抗酸化剤を処理すると活性が抑制されることがわかった。このことにより、持続的な抗酸化剤処理によって正常細胞においては放射線による細胞老化が抑制できることがわかった。対照的に、野生型p53を有するRKO細胞を含む癌細胞においては放射線によって細胞老化が誘導されないことがわかった。タンパク質の発現を解析した結果、抗酸化剤を処理してもATM、p53、p21の発現が変化しなかった。今後、遅発性活性酸素種が老化関連炎症性物質（SASP因子）の発現に関与するか、活性酸素種によるATMの発現制御機構の解明を行う予定である。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

当該年度では放射線照射による遅発性活性酸素種の産生が正常細胞とがん細胞とで異なるのか、正常ヒト胎児由来細胞と口腔癌細胞を用いて検討し、さらに抗酸化剤を用いて遅発性活性酸素種を抑制することで正常細胞を防護でき得るか細胞増殖、細胞老化、DNA 損傷数で比較検討することを予定していた。当初の計画通り、正常細胞とがん細胞とで放射線照射後の細胞老化誘導に違いがあることを明らかにし、さらにその原因となるタンパク質の発現に違いがあることを明らかにできた。また、照射後の遅発性活性酸素種が増加する原因として、ミトコンドリア呼吸能の変化であることが実験結果より示唆された。さらにこのミトコンドリア呼吸能の変化は正常細胞のみならず、癌細胞においても誘導されることがわかった。SASP因子の発現についてはRNA抽出までできているので、発現量について今後検討する予定である。

今後の研究の推進方策

これまでの結果より、アスコルビン酸誘導体処理が放射線治療後の正常細胞保護に有効である可能性を示唆している。前述のとおり、がん細胞では遅発性活性酸素が抑制されている可能性があるので、がん細胞と正常細胞が混在するがん組織の照射野においては、アスコルビン酸による遅発性活性酸素の除去は、相対的にがん細胞よりも正常細胞において大きな防護効果を発揮する可能性が高い。この検証を細胞レベルと動物レベル（マウス）で調べる。まず、正常細胞において、遅発性活性酸素を有効に抑制するアスコルビン酸誘導体処理の条件を見出す。遅発性活性酸素は照射数日後（3日）がピークになるよう誘導されるので、照射数時間後から数日後にかけて遅発性活性酸素が抑制されるアスコルビン酸誘導体処理条件を検討する。
上述の「遅発性活性酸素を抑制するがん細胞特異的細胞外因子」を抑制する手法、及びアスコルビン酸誘導体を処理する手法（それぞれの手法と両者を組み合わせた手法）を動物レベルで検証する。放射線照射による担癌マウスのがん増殖抑制、及び正常組織の障害の保護効果について検証する。以下の実験を行う。
①ヌードマウスにがん細胞を移植し、がん細胞の増殖率を腫瘍の体積により測定する。
②放射線照射の有無、細胞外因子の抑制の有無、もしくはアスコルビン酸誘導体投与の有無それぞれの群に分け、各群におけるがん細胞の増殖抑制効果を調べる。
③放射線照射の有無、細胞外因子の抑制の有無、もしくはアスコルビン酸誘導体投与の有無それぞれの群に分け、各群における正常組織への影響を比較する。具体的には皮膚の紅班の評価、及び正常組織の凍結切片により、細胞のDNA二本鎖切断数について53BP1フォーカス形成を用いて比較検討する。

次年度使用額が生じた理由

概ね順調に使用し、24178円を繰り越した。

研究成果

• [雑誌論文] ATR inhibition enhances 5-fluorouracil sensitivity independent of non-homologous end-joining and homologous recombination repair pathway (2020)
  • 著者名/発表者名: Ito SS, Nakagawa Y, Matsubayashi M, Sakaguchi YM, Kobashigawa S, Matsui TK, Nanaura H, Nakanishi M, Kitayoshi F, Kikuchi S, Kajihara A, Tamaki S, Sugie K, Kashino G, Takahashi A, Hasegawa M, Mori E
  • 雑誌名: bioRxiv 巻: - ページ: -
  • DOI: 10.1101/2020.04.20.051318
  • オープンアクセス
• [雑誌論文] Brainstem organoids from human pluripotent stem cells contain neural crest population (2020)
  • 著者名/発表者名: Eura N et al.
  • 雑誌名: Frontiers in Neuroscience 巻: - ページ: -
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Human URAT1/SLC22A12 gene promoter is regulated by 27-hydroxycholesterol through estrogen response elements (2019)
  • 著者名/発表者名: Matsubayashi M, Sakaguchi YM, Sahara Y, Nanaura H, Kikuchi S, Ashari A, Bui L, Kobashigawa S, Nakanishi M, Nagata R, Matsui TK, Kashino G, Hasegawa M, Takasawa S, Eriguchi M, Tsuruya K, Nagamori S, Sugie K, Nakagawa T, Takasato M, Umetani M, Mori E
  • 雑誌名: bioRxiv 巻: - ページ: -
  • DOI: 10.1101/827709
  • オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Stress-induced Cellular Senescence Contributes to Chronic Inflammation and Cancer Progression (2019)
  • 著者名/発表者名: Kobashigawa S, Sakaguchi YM, Masunaga S, Mori E
  • 雑誌名: Thermal Medicine 巻: 35(4) ページ: 41-58
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] グルコピラノシルアスコルビン酸の照射後処理による正常細胞の防護効果 (2020)
  • 著者名/発表者名: 小橋川新子、新家英、菓子野元郎、森英一朗
  • 学会等名: 第22回菅原・大西記念癌治療増感シンポジウム
• [学会発表] Different response to radiation-induced delayed oxidative stress in normal cells and cancer cells. (2020)
  • 著者名/発表者名: Kobashigawa S., Niinomi A., Kashino G., Mori E
  • 学会等名: The 8th GIAR International Symposium
  • 国際学会
• [学会発表] Delayed ROS related to mitochondrial fission causes cellular senescence after radiation exposure. (2019)
  • 著者名/発表者名: Kobashigawa S., Mori E
  • 学会等名: ASUKA Symposium 2019
  • 国際学会
• [学会発表] 遅発性活性酸素種に対する正常細胞とがん細胞との応答の違いはあるのか (2019)
  • 著者名/発表者名: 小橋川新子、新家英、菓子野元郎、森英一朗
  • 学会等名: 日本放射線影響学会 第62回大会