| 研究課題/領域番号 |
19K08278
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| 研究機関 | 岡山大学 |
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研究代表者 |
津下 充 岡山大学, 医歯薬学総合研究科, 講師 (80625004)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | 脳血管内皮細胞 / 炎症性サイトカイン / HMGB-1 / 血管透過性 / タイトジャンクション / ストレスファイバー / IL-6 / COX-2 |
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| 研究実績の概要 |
自然免疫メディエーターの一つであるHigh mobility group box-1（HMGB-1）に着目し、腫瘍壊死因子（TNF-α）によるヒト初代脳血管内皮細胞の血管透過性亢進をHMGB-1モノクローナル抗体が抑制しうるか検討した。
まず、初代ヒト脳血管内皮細胞においてHMGB-1の受容体であるRAGEやTLR4が存在することを免疫染色で確認した。次にTNF-α（10 ng/ml、24時間）刺激によって上清中のHMGB-1濃度が有意に増加することを明らかにした。TNF-α（10 ng/ml、24時間）、抗HMGB-1抗体（100μg/ml、24時間）の添加によって細胞生存率に有意な変化は認めなかった。
脳血管内皮透過性をトランスウェルを用いて下室に透過した蛍光色素結合アルブミンで定量した。TNF-α（10 ng/ml、24時間）刺激後に血管透過性は有意に亢進したが、抗HMGB-1抗体（100μg/ml）の存在下で有意に血管透過性亢進は抑制された。
TNF-α刺激によって脳血管内皮細胞は紡錘状に変形し、ファロイジン染色でアクチンストレスファイバーの形成の増加を認めた。脳血管内皮細胞間のタイトジャンクション分子の1つであるVEカドヘリンはTNF-αの刺激によって減少し細胞間間隙の形成が増加した。抗HMGB-1抗体（100μg/ml）の存在下では、ストレスファイバーの増加と細胞の紡錘化は抑制されなかったが、VEカドヘリンの減少が抑制され、細胞間間隙も減少した。
TNF-α刺激によって上清中のIL-6濃度は有意に増加し、細胞内COX-2遺伝子発現が増加したが、抗HMGB-1抗体（100μg/ml）の存在下でいずれも有意に抑制された。抗HMGB-1抗体がTNF-α刺激による脳血管透過性亢進を抑制し、COX-2遺伝子発現抑制によるIL-6産生を低下させることを明らかにした。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
研究計画における1つの目標であるヒト脳血管内皮細胞に対するHMGB-1モノクローナル抗体の透過性抑制効果について明らかにすることができた。そのメカニズムについては順調に解析を進めることができているが、さらに詳細な検討は今後も必要であると考える。
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| 今後の研究の推進方策 |
HMGB-1モノクローナル抗体によるヒト脳血管内皮細胞の透過性亢進の抑制のメカニズムについてさらに詳細な検討を継続する。
並行して、インフルエンザ脳症モデルマウスに対するHMGB-1モノクローナル抗体の投与と、脳血管透過性亢進の抑制のメカニズムについて、細胞実験で得られた結果をもとに進めていく。
ヒト末梢血単核球を用いた抗HMGB-1抗体の有効性の検討については倫理委員会の申請・承認を進めているところである。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
2019年度の研究はすでに研究室に試薬が残っており、さらに必要な機器についても共同実験室での使用で継続することができたため、当初の見積額よりも安価に実施することができ、不足した試薬の購入のみに経費のみに使用したため、次年度使用額が生じた。しかし、次年度は細胞実験における新規のアッセイを開始し、また動物実験のための動物や器具の購入も必要であり、費用を要することが判明している。次年度使用額を有効かつ計画的に使用する予定である。
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