| 研究課題/領域番号 |
19K08284
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| 研究機関 | 日本医科大学 |
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研究代表者 |
荻原 郁夫 日本医科大学, 医学部, 准教授 (30373286)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | 電位依存性ナトリウムチャネル / タンパク複合体 / てんかん / 自閉症 |
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| 研究実績の概要 |
電位依存性ナトリウムチャネルの細胞膜発現やチャネル機能の制御機構については不明な点が多く残されている。本研究課題の目的は電位依存性ナトリウムチャネルNav1.1と複合体を形成する分子のNav1.1制御機構における役割を明らかにし、てんかんと自閉症の治療開発に貢献することである。
電位依存性ナトリウムチャネルのαサブユニットは４つの６回膜貫通ドメインから構成される250 kDのタンパク質で、N末端とC末端、そして３か所のドメイン間ループが細胞質側にある。これら細胞質側ドメインのうち、推定上のリン酸化部位があるI－IIループとEFハンド様モチーフを形成するC末端をNav1.1側相互作用領域として選定し、この２領域のHAタグ付き発現ベクターを作製した。同時に、以前の液体クロマトグラフィー・タンデム質量分析法で同定した候補タンパクA, B, CのV5タグ付き発現ベクターを作製した。また、陽性コントロールとしてNav1.1のC末端との相互作用が既知のカルモジュリンを用意した。これら発現ベクターをHEK293細胞に共トランスフェクションして細胞抽出液を調整し、HAあるいはV5タグの抗体で免疫沈降を施行した。そして、免疫沈降産物についてウエスタンブロット法を施行した。その結果、候補タンパクAとBはI－IIループを介してNav1.1と相互作用することが示唆された。一方、候補タンパクCはI－IIループとC末端のどちらにも結合しないことが示唆された。カルモジュリンは、報告の通り、Nav1.1とC末端と結合した。また、全長Nav.1.1発現ベクターでも同様の実験を行ったが、全長Nav1.1の発現量が極めて低いことが原因で、相互作用は検出できなかった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
候補タンパクAについて、Nav1.1との相互作用を確認し、その部位がI－IIループであることを明らかにした。候補タンパクBについて、これまでの他のチャネル研究からC末端に結合すると予想したが、Nav1.1ではI－IIループが相互作用部位であることを明らかにした。これらタンパクAとBがNav1.1のキネティクスに及ぼす影響の解析もセットした。以上のことから、計画はおおむね順調に推移しているということができる。
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| 今後の研究の推進方策 |
タンパクAとBがNav1.1の局在やキネティクスに及ぼす影響をHEK293細胞や初代神経培養細胞を用いて、分子細胞生物学ならびに電気生理学的に解析する。全長Nav1.1は強制発現系では発現量が少ない。近年、強制発現系における翻訳能率を最適化するコドンパターンの報告があり、全長Nav1.1への導入を検討している。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
（理由）牛胎児血清を含む細胞培養関連試薬やトランスフェクション関連試薬、PCR関連試薬は大学研究室配分研究経費で購入したものの中から一部を使用させてもらった。免疫沈降法の抗体ビーズとウエスタンブロットのPVDFメンブレンは以前の研究プロジェクトで購入して残っていたものから使用した。
（使用計画）細胞培養関連試薬、電気泳動用ゲル、抗体、トランスフェクション関連試薬、標本作製用器具、電気生理学的解析試薬、siRNA、PCR関連試薬を購入する。
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