| 研究課題/領域番号 |
19K08294
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| 研究機関 | 新潟大学 |
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研究代表者 |
渡邉 香奈子 新潟大学, 医歯学系, 准教授 (80626094)
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| 研究分担者 |
齋藤 昭彦 新潟大学, 医歯学系, 教授 (30531389)
樋口 雅也 金沢医科大学, 医学部, 教授 (50334678)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | ウイルス受容体 / ヒトパレコウイルス3型 / 蛍光タンパク質発現組換えヒトパレコウイルス3型 / レトロウイルスベクター / cDNAライブラリー |
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| 研究実績の概要 |
ヒトパレコウイルス3型（HPeV-3）は、多くの場合、軽微な胃腸炎や上・下気道炎などをきたす乳幼児感染症の原因ウイルスである。しかしながら、HPeV-3が新生児あるいは早期乳児に感染すると、敗血症様症候群、脳脊髄膜炎などの重症感染症を発症し、4カ月未満児の入院率は7.5人/1,000人である。HPeV-3は腸管上皮もしくは気道上皮細胞などに感染すると考えられているが、感染機構、宿主細胞域の全体像、感染の組織特異性および重症感染症を引き起こす分子機構は不明である。
本研究ではHPeV3のウイルス受容体を同定することによって、宿主細胞域や組織特異性を明らかにする。更に、同定した受容体を発現する動物モデルを樹立し、個体レベルでのHPeV-3感染症の分子機構を解析することにより、新生児において重症化する病態の全容解明を目指している。
本年度は、HPeV-3高感受性LLC-MK2細胞からcDNAライブラリーを作製した。また、cDNAライブラリーの選別に用いるUnaG（緑色蛍光タンパク質）発現組換えHPeV-3（UnaG-HPeV-3）も作製した。UnaG-HPeV-3は細胞に感染して、ウイルスタンパク質の合成が始まるとUnaGが発現する組換えウイルスである。先ずは、一次スクリーニングとして、高感受性LLC-MK2細胞由来cDNAをレトロウイルスベクターによって、HPeV-3非感受性であるBHK-21細胞に発現させた。それらの細胞に、UnaG-HPeV-3を感染させ、蛍光顕微鏡下でUnaG発現細胞が存在するcDNAライブラリープールを選別した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
HPeV-3高感受性LLC-MK2細胞のcDNAライブラリーのcDNAフラグメントの長さは平均1.8kbであった。このcDNAライブラリーを一つのプールが約1,000クローンのcDNAを含んでいるプールとなるように調整し、150プールに分割した。合計約15万クローンのcDNAについてUnaG-HPeV-3を用いて一次スクリーニングを行った。150プールの中から、UnaGの緑色蛍光が観察され陽性となった2つのライブラリープールを選別した。
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| 今後の研究の推進方策 |
引き続き陽性ライブラリープールのスクリーニングを行い、HPeV-3受容体を単離・同定する。さらに、HPeV-3受容体遺伝子の変異体を作製し、ウイルス感染に関わる遺伝子構造を明らかにし、HPeV-3感染における機能を解析する予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本年度の研究計画が順調に遂行し、128,133円の次年度使用が生じた。この費用は、次年度の実験消耗品の購入費用に充てる。
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