| 研究課題/領域番号 |
19K08294
|
|---|
| 研究機関 | 新潟大学 |
|---|
研究代表者 |
渡邉 香奈子 新潟大学, 医歯学系, 准教授 (80626094)
|
|---|
| 研究分担者 |
齋藤 昭彦 新潟大学, 医歯学系, 教授 (30531389)
樋口 雅也 金沢医科大学, 医学部, 教授 (50334678)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2023-03-31
|
| キーワード | ウイルス受容体 / ヒトパレコウイルス3型 / 蛍光タンパク質発現組換えヒトパレコウイルス3型 / CRISPR/ Cas9 |
|---|
| 研究実績の概要 |
ヒトパレコウイルス3型（HPeV-3）は、多くの場合、軽微な胃腸炎や上・下気道炎などをきたす乳幼児感染症の原因ウイルスである。しかしながら、HPeV-3が新生児あるいは早期乳児に感染すると、敗血症様症候群、脳脊髄膜炎などの重症感染症を発症し、4カ月未満児の入院率は7.5人/1,000人である。HPeV-3は腸管上皮もしくは気道上皮細胞などに感染すると考えられているが、感染機構、宿主細胞域の全体像、感染の組織特異性および重症感染症を引き起こす分子機構は不明である。
本研究ではHPeV-3のウイルス受容体を同定することによって、宿主細胞域や組織特異性を明らかにする。更に、同定した受容体を発現する動物モデルを樹立し、個体レベルでのHPeV-3感染症の分子機構を解析することにより、新生児において重症化する病態の全容解明を目指している。
HPeV-3高感受性LLC-MK2細胞のレトロウイルスライブラリーのスクリーニングを行った。ライブラリーの選別に用いるUnaG（緑色蛍光タンパク質）発現組換えHPeV-3（HPeV-3-UnaG）を作製した。HPeV-3-UnaGは細胞に感染して、ウイルスタンパク質の合成が始まるとUnaGが発現する組換えウイルスである。一次スクリーニングではUnaGの緑色蛍光が観察された２つの陽性プールを選別したが、二次スクリーニングにおいて陽性プールが消失し、受容体候補遺伝子の単離には至らなかった。
一方、HPeV-3受容体遺伝子の単離をCRISPR/ Cas9ヒト全ゲノムノックアウトレンチウイルスライブラリーを用いて試みて、23の受容体候補遺伝子を得た。これらの受容体候補遺伝子のうち、最もノックアウトされていた遺伝子（A）が受容体である確率が最も高いと判断し、この遺伝子について検証実験を実施した。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
HPeV-3非感受性であるハムスター腎由来BHK-21細胞に受容体候補分子Aを強制発現させて、HPeV-3を感染させた。受容体候補分子A発現BHK細胞から感染性HPeV-3が得られた。また、HPeV-3高感受性であるヒト十二指腸由来HuTu-80細胞の受容体候補遺伝子AをノックアウトしてHPeV-3の感染実験を行った。受容体候補遺伝子AノックアウトHuTu-80細胞から感染性のHPeV-3は得られなかった。さらに、HPeV-3以外のHPeV遺伝子型（HPeV-1～HPeV-6）についても同様の感染実験を行った。候補分子A発現BHK細胞では各遺伝子型の感染性ウイルスが得られ、候補遺伝子Aノックアウト細胞では感染性ウイルスは得られなかった。候補分子AはHPeV-3に特異的な受容体ではなく、HPeVに共通した受容体であることが示唆された。
|
| 今後の研究の推進方策 |
HPeV-3と受容体候補分子Aとの結合を確認する。また、受容体候補分子Aとマウス分子Aとのキメラを作成し、候補分子AのHPeV-3受容体として重要な領域を決定する予定である。更に、受容体候補分子Aを発現する動物モデルの樹立を試みる。
|
| 次年度使用額が生じた理由 |
本年度の研究計画が順調に遂行でき、650,556円の次年度使用が生じた。この費用は、次年度の実験消耗品の購入費用および論文投稿費用に充てる。
|
