| 研究課題/領域番号 |
19K08294
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| 研究機関 | 新潟大学 |
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研究代表者 |
渡邉 香奈子 新潟大学, 医歯学系, 准教授 (80626094)
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| 研究分担者 |
齋藤 昭彦 新潟大学, 医歯学系, 教授 (30531389)
樋口 雅也 金沢医科大学, 医学部, 教授 (50334678)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | ウイルス受容体 / 細胞への侵入 / ヒトパレコウイルス3型 / 蛍光タンパク質発現組換えヒトパレコウイルス3型 / CRISPR/ Cas9 |
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| 研究実績の概要 |
ヒトパレコウイルス3型（PeV-A3）は、多くの場合、軽微な胃腸炎や上・下気道炎などをきたす乳幼児感染症の原因ウイルスである。しかしながら、PeV-A3が新生児あるいは早期乳児に感染すると、敗血症様症候群、脳脊髄膜炎などの重症感染症を発症し、4カ月未満児の入院率は7.5人/1,000人である。PeV-A3は腸管上皮もしくは気道上皮細胞などに感染すると考えられているが、感染機構、宿主細胞域の全体像、感染の組織特異性および重症感染症を引き起こす分子機構は不明である。
本研究ではPeV-A3のウイルス受容体を同定することによって、宿主細胞域や組織特異性を明らかにする。更に、同定した受容体を発現する動物モデルを樹立し、個体レベルでのPeV-A3感染症の分子機構を解析することにより、新生児において重症化する病態の全容解明を目指している。
ヒト由来PeV-A3高感受性細胞（HuTu-80）とヒト遺伝子をターゲットとするCRISPR/Cas9ライブラリーを用いてゲノムワイドランダムノックアウトスクリーニングを実施し、最も多くノックアウトされたMyeloid-associated differentiation marker (MYADM)遺伝子について検討を行った。
ハムスター由来のPeV-A3非感受性細胞（BHK-21）にMYADMを強制発現させたBHK-MYADM細胞にPeV-A3を感染させると、細胞変性効果（CPE）の出現と感染性ウイルスの産生が確認された。次に、HuTu-80細胞において、MYADM遺伝子をノックアウトしたMYADM-KO細胞ではCPEの出現と感染性ウイルスの産生は認められなかった。
PeV-A3以外のPeV-A1, A2, A4, A5, A6についてもMYADM-KO細胞とBHK-MYADM細胞への感染実験を行い、PeV-A3と同様の結果を得た。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
FLAGタグを付加したMYADM遺伝子（FLAG-MYADM）の発現細胞とPeV-A3とを反応させ、FLAG抗体で免疫沈降することにより、FLAG-MYADMとPeV-A3のVP0とが、特異的に結合することが示された。
マウス由来のNIH/3T3細胞はBHK-21細胞と同様にPeV-A3非感受性であった。ヒトのMYADMは８回膜貫通タンパク質で、存在する4つの細胞外領域のうち最も長い第4細胞外領域にPeV-A3が結合すると考え、ヒトとマウスのMYADMの第4細胞外領域のみを置換したキメラ遺伝子を作製し、BHK-21細胞に導入してPeV-A3の感染実験を行った。PeV-A3はマウスMYADMをベースにしたヒトMYADMの第4細胞外領域を発現するBHK-F-MHM細胞に感染し、CPEの出現と感染性ウイルスの産生が確認された。一方、PeV-A3はヒトMYADMをベースにしたマウスMYADMの第4細胞外領域を発現するBHK-F-HMH細胞に感染しなかった。また、FLAGタグを付加したヒトMYADM遺伝子の発現細胞（BHK-NF-MYADM）とPeV-A3のVP0とが特異的に結合したが、マウスMYADM遺伝子の発現細胞（BHK-MF-MYADM）とは結合しなかった。更に、ヒトとマウスのキメラ遺伝子の発現細胞では、BHK-F-MHM細胞に結合したが、BHK-F-HMH細胞には結合せず、ヒトMYADMの第4細胞外領域に結合することが示された。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後は、ヒトMYADMを発現する動物モデルの樹立を試み、MYADMを介したPeV-A感染について解析を行い、新生児におけるPeV-A3感染症の重症化機構を明らかにする予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本年度の研究計画が順調に遂行でき、302,215円の次年度使用が生じた。この費用は、次年度の実験消耗品の購入費用に充てる。
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