機能獲得型変異による原発性免疫不全症へのゲノム編集を用いた新規遺伝子治療の開発

2019 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 19K08312
• 研究機関: 国立研究開発法人国立成育医療研究センター
• 研究代表者: 内山 徹 国立研究開発法人国立成育医療研究センター, 成育遺伝研究部, 室長 (10436107)
• 研究分担者: 西増 弘志 東京大学, 大学院理学系研究科(理学部), 准教授 (00467044)
• 研究期間 (年度): 2019-04-01 – 2022-03-31
• キーワード: ゲノム編集 / Cas9 / 機能獲得型変異 / 変異アリル特異的

研究実績の概要

2019年度は、T細胞および造血幹細胞においてゲノム編集を実施するための様々な条件検討を行った。本開発では、Cas9およびガイドRNAの導入にはウイルスベクターではなく、エレクトロポレーションを用いることで、安全性の上昇とコストの低下を図り、臨床応用における優位性を確保する。
まず、Cas9とガイドRNAの量および比率を検討するために、さまざまな条件によるT細胞を標的としたCD3遺伝子のノックダウンを行った。その結果、Cas9の濃度は4uMであり、またCas9とガイドRNAの比率は1:5が最も高い効率でのゲノム編集が可能であった。さらに、エレクトロポレーションの条件を最適化することで、生存率をほぼ100％に保ったまま、90％以上のノックダウン効率を達成することができた。次に、CD 34陽性細胞に効率よく導入するための条件検討を実施した。サイトカインの種類、各サイトカインの濃度を調整することで、臍帯血由来のCD 34陽性細胞に対して、ほぼ100％の導入が可能となった。
片アリルの機能獲得型変異に対するゲノム編集では、変異アリルのみを認識する必要がある。変異アリルに対するガイドRNAの配列の検討を目的として、活性化PI3KΔ症候群（APDS）の原因となるPIK3CD遺伝子のホットスポット変異であるE1021Kを片アリルにもつ細胞株を現在作製中である。一方で、同様に片アリルの変異によって発症する高IgE症候群患者（STAT3変異）の細胞を用いた解析では、PAM配列の上流10－12塩基以内に変異が位置する場合に、変異アリル特異的な認識が可能となり、変異アリルの80％程度にindelの挿入が可能であることがわかった。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

Cas9によるゲノム編集技術の臨床応用を考えた場合、細胞毒性を抑えかつ高い効率で編集を行わなければならず、そのためには、Cas9の導入に関して、様々な条件検討が必要となる。導入に関しては、Cas9の形状（DNA, mRNA, タンパク）、量、ガイドRNAとの比率、さらには導入方法の選択などが挙げられる。さらに、ガイドRNAによっても効率が大きく変わることから、複数の配列での検討が必要である。
そのほか遺伝子治療への応用には、より細胞毒性がなく、また標的細胞の性質を変えることなく導入するため、培養法などの検討も重要である。
本年度は、これらの項目に関して一つ一つ検討を重ね、今後の実験における各種条件の最適化を終了した。

今後の研究の推進方策

１）変異特異的ゲノム編集の実施：2019年度に作製したE1021K変異細胞に対して、確立した条件を用いて変異アリル特異的なゲノム編集を実施する。変異アリルのノックダウン（Cas9+ガイドRNAの導入）では、正常アリルをそのままに、変異アリルのみにindelの挿入が可能であるかを確認する。変異アリルの修復（Cas9+ガイドRNA+ドナーの導入）では、変異アリル配列の正常配列への変換が可能かを確認する。
さらに、確立した方法を用いて、APDS患者の造血幹細胞、T細胞に対してゲノム編集を実施し、その効率を検討する。
２）ゲノム編集後の細胞の機能解析：ゲノム編集による、PI3K経路の恒常的活性化の改善を検討するAPDS患者では、健常人に比べて恒常的にAktのリン酸化が起こることから、ゲノム編集後のT細胞においてリン酸化の正常化が可能かをフローサイトメトリーを用いて確認する。一方で、PI3K/Akt経路は正常な細胞の分化や増殖に必要であるが、変異アリルのノックダウンでは正常アリルが通常の半分となることから、機能低下を引き起こす可能性が否定できない。これらを確認するために、ゲノム編集後のT細胞の増殖やサイトカイン産性に関して、健常人細胞と比較を行う。さらに、編集後の造血幹細胞をNOGマウスに移植することで、in vivoでのT細胞やB細胞の分化について解析を行う。T細胞の異常増殖の改善の一方で、片アリルを破壊したことによる正常な分化や増殖の抑制に関して検討する。
３）安全性の評価：臨床応用に向けた安全性評価を目的として、オフターゲット効果について検討する。申請者の所属する研究室では、すでに、GUIDEseq法を確立しており、本研究にてゲノム編集を行ったT細胞、造血幹細胞におけるオフターゲット効果の評価を実施する。

次年度使用額が生じた理由

2019年度は、ゲノム編集を実施するためのCas9の導入条件の検討を中心に行った。様々な条件検討が必要であったものの、疾患の細胞株を樹立することができ、この細胞株を使用することで大半の実験が可能となった。マウスや患者細胞などのプライマリー細胞の使用は限られたことから、これらの培養に必要な高額なサイトカインの使用が当初の計画に比べて抑えられた。一方で、2020年度は、疾患におけるゲノム編集の有効性を確認するため、マウスモデルや患者細胞を用いた実験が主体となることが予想され、これらに使用する予定である。

研究成果

• [雑誌論文] Comparison of clonazepam and levetiracetam in children for prevention of busulfan-induced seizure in hematopoietic stem cell transplantation. (2020)
  • 著者名/発表者名: 11.Tsujimoto SI, Shirai R, Utano T, Osumi T, Matsumoto K, Shioda Y, Kiyotani C, Uchiyama T, Deguchi T, Terashima K, Tomizawa D, Matsumoto K, Kato M.
  • 雑誌名: Int J Hematol. 巻: 111 ページ: 463-466
  • DOI: 10.1007/s12185-019-02795-8
  • 査読あり
• [雑誌論文] Direct assessment of a single-cell DNA using crudely purified live cells: a proof of concept for noninvasive prenatal definitive diagnosis. (2020)
  • 著者名/発表者名: Saito T, Ito Y, Samura O, Aoki H, Uchiyama T, Okamoto A, Hata K
  • 雑誌名: J Mol Diagn. 巻: 22 ページ: 132-140
  • DOI: 10.1016/j.jmoldx.2019.10.006.
  • 査読あり
• [雑誌論文] High prevalence of SMARCB1 constitutional abnormalities including mosaicism in malignant rhabdoid tumours. (2020)
  • 著者名/発表者名: Shirai R, Osumi T, Terashima K, Kiyotani C, Uchiyama M, Tsujimoto S, Yoshida M, Yoshida K, Uchiyama T, Tmizawa D, Shioda Y, Sekiguchi M, Watanabe K, Keino D, Ueno-Yokohata H, Ohki K, Takita J, Ito S, Deguchi T, Kiyokawa N, Ogiwara H, Hishiki T, Ogawa S, Okita H, Matsumoto K, Yoshioka T, Kato M.
  • 雑誌名: Eur J Hum Genet. 巻: Epub ahead of print ページ: N/A
  • DOI: doi: 10.1038/s41431-020-0614-z.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Low prevalence of maternal microchimerism in peripheral blood of Japanese children with type I diabetes. (2019)
  • 著者名/発表者名: Ushijima K, Okuno M, Ayabe T, Kikuchi N, Kawamura T, Urakami T, Yokota I, Amemiya S, Uchiyama T, Kikuchi T, Ogata T, Sugihara S, Fukami M
  • 雑誌名: Diabet Med. 巻: Epub ahead of print ページ: N/A
  • DOI: 10.1111/dme.14221.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Haploinsufficiency of A20 caused by a novel nonsense variant or entire deletion of TNFAIP3 is clinically distinct from Behcet disease. (2019)
  • 著者名/発表者名: Tsuchida M, Kirino Y, Soejima Y, Onodera M, Arai K, Tamura E, Ishikawa T, Kawai T, Uchiyama T, Nomura S, Kobayashi D, Taguri M, Mitsuhashi T, Takata A, Miyake N, Nakajima H, Miyake S, Matsumoto N
  • 雑誌名: Arthritis Res Ther. 巻: 21 ページ: 137
  • DOI: 10.1186/s13075-019-1928-5
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] ABO-incompatible liver transplantation for children under 2 years of age: A case report and a single-center review. (2019)
  • 著者名/発表者名: Narumoto S, Sakamoto S, Sasaki K, Hirata Y, Fukuda A, Uchiyama T, Irie R, Yoshida T, Kasahara M.
  • 雑誌名: Pediatr Transplant. 巻: 23 ページ: e13308.
  • DOI: doi: 10.1111/petr.13308
  • 査読あり
• [雑誌論文] A prospective study of allogeneic transplantation from unrelated donors for chronic granulomatous disease with target busulfan-based reduced-intensity conditioning (2019)
  • 著者名/発表者名: Osumi T, Tomizawa D, Kawai T, Sako M, Inoue E, Takimoto T, Tamura E, Uchiyama T, Imadome K, Taniguchi M, Shirai R, Yoshida M, Ando R, Tsumura Y, Fuji H, Matsumoto K, Shioda Y, Kiyotani C, Terashima K, Onodera M, Matsumoto K, Kato M.
  • 雑誌名: Bone Marrow Transplant 巻: 54 ページ: 168-172
  • DOI: 10.1038/s41409-018-0271-9
  • 査読あり
• [学会発表] Progress of gene therapy for primary immunodeficiency diseases. (2020)
  • 著者名/発表者名: 内山 徹
  • 学会等名: 第10回 国際協力遺伝病遺伝子治療フォーラム 第10周年記念大会
  • 招待講演
• [学会発表] レンチウイルスベクターの品質・安全管理 (2020)
  • 著者名/発表者名: 内山 徹
  • 学会等名: 第20回医薬品等ウイルス安全性シンポジウム
  • 招待講演
• [学会発表] Progress in the treatment of primary immunodeficiency -enzyme replacement therapy and gene therapy- (2020)
  • 著者名/発表者名: 内山 徹
  • 学会等名: 第3回日本免疫不全・自己炎症学会
  • 招待講演
• [学会発表] Insertional Oncogenesis in X-CGD Patient after MFGS Retroviral Vector-Mediated Gene Therapy. (2019)
  • 著者名/発表者名: Toru Uchiyama
  • 学会等名: 22nd Annual meeting of American Society of Gene and Cell therapy.
  • 国際学会
• [学会発表] Single cell-based vector tracing in patients with ADA-SCID treated with stem cell gene therapy. (2019)
  • 著者名/発表者名: Toru Uchiyama
  • 学会等名: 2019 Cell Therapy Seminar
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Progress of gene therapy for primary immunodeficiency. (2019)
  • 著者名/発表者名: 内山 徹
  • 学会等名: 第25回 日本遺伝子細胞治療学会
  • 招待講演
• [学会発表] X連鎖慢性肉芽腫症へのレトロウイルスベクターによる遺伝子治療における発がん挿入変異の解析 (2019)
  • 著者名/発表者名: 内山 徹
  • 学会等名: 第81回日本血液学会学術集会