機能獲得型変異による原発性免疫不全症へのゲノム編集を用いた新規遺伝子治療の開発

2021 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 19K08312
• 研究機関: 国立研究開発法人国立成育医療研究センター
• 研究代表者: 内山 徹 国立研究開発法人国立成育医療研究センター, 成育遺伝研究部, 室長 (10436107)
• 研究分担者: 西増 弘志 東京大学, 先端科学技術研究センター, 教授 (00467044)
• 研究期間 (年度): 2019-04-01 – 2022-03-31
• キーワード: 遺伝子治療 / 機能獲得型変異 / ゲノム編集 / 変異アレル特異的編集

研究実績の概要

活性化PI3K delta症候群（APDS）をはじめとする機能獲得型変異による疾患に対するゲノム編集では、変異アレルのみを編集する必要がある。変異アレル特異的な認識と編集の開発のため、APDSの原因となるPIK3CD遺伝子のホットスポット変異であるE1021Kを片アリルにもつT細胞株を樹立した。片アレルの機能獲得型変異によることから樹立した細胞に対して、変異部位がシード配列に位置するようガイドRNAを設計し、変異アレルのみの認識と破壊を試みた。複数のガイドRNAを設計し、各ガイドRNAにおける切断効率を、次世代シーケンサーを用いて解析した。その結果、最も効率の高い条件では、80％程度のindel挿入が可能であり、indel挿入によるフレームシフトの誘導は70％であった。APDS患者では、PI3K/Aktシグナルの恒常活性化が起こることから、変異アレルの破壊によるシグナル伝達の正常化に関して、患者細胞を用いた解析を実施した。まず、ホットスポットであるE525KおよびE1021Kを持つAPDS患者よりT細胞株を樹立した。これらの細胞株では、健常人由来T細胞株に比較し、Aktのリン酸化の亢進が認められた。次に、各変異に対して同様にゲノム編集を実施したところ、70-80%の効率で変異荒れる特異的なindel挿入が可能であった。これらの細胞におけるAktのリン酸化を解析したところ、ゲノム編集前の患者T細胞に比べて、リン酸下の低下が認められた。一方で、本来２copy存在するPIK３CDの方アレルを破壊することから、haploinsufficiencyによる影響が出る可能性もある。In vivoにおける解析のため、ヒトPIK３CD遺伝子変異に対応する変異を持つマウスの作製を行なっている。

研究成果

• [雑誌論文] Nonconditioned ADA-SCID gene therapy reveals ADA requirement in the hematopoietic system and clonal dominance of vector-marked clones. (2021)
  • 著者名/発表者名: Uchiyama T, Sirirat Takahashi S, Nakabayashi K, Okamura K, Edasawa K, Yamada M, Watanabe N, Mochizuki E, Yasuda T, Miura A, Kato K, Tomizawa D, Otsu M, ArigaT , Onodera M.
  • 雑誌名: Molecular Therapy: Methods & Clinical Development 巻: 23 ページ: 424-433
  • DOI: 10.1016/j.omtm.2021.10.003
  • 査読あり
• [雑誌論文] Bacillus Calmette-Guerin (BCG) infections at high frequency in both AR-CGD and X-CGD patients following BCG vaccination. (2021)
  • 著者名/発表者名: Ishikawa T, Okai M, Mochizuki E, Uchiyama T, Onodera M, Kawai T.
  • 雑誌名: Clin Infect Dis 巻: 73(9) ページ: e2538-e2544
  • DOI: 10.1093/cid/ciaa1049
  • 査読あり
• [雑誌論文] Autoimmune hemolytic anemia associated with Takenouchi-Kosaki syndrome. (2021)
  • 著者名/発表者名: Ishikawa K, Uchiyama T, Kaname T, Kawai T, Ishiguro A.
  • 雑誌名: Pediatr Int. 巻: 63(12) ページ: 1528-1530
  • DOI: 10.1111/ped.14651.
  • 査読あり
• [雑誌論文] ETV6-related thrombocytopenia associated with a transient decrease in von Willebrand factor. (2021)
  • 著者名/発表者名: Kanamaru Y, Uchiyama T, Kaname T, Yanagi K, Ohara O, Kunishima S, Ishiguro A.
  • 雑誌名: Int J Hematol. 巻: 114(2) ページ: 297-300
  • DOI: 10.1007/s12185-021-03136-4.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Severe Liver Disorder Following Liver Transplantation in STING-Associated Vasculopathy with Onset in Infancy. (2021)
  • 著者名/発表者名: Ishikawa T, Tamura E, Kasahara M, Uchida H, Higuchi M, Kobayashi H, Shimizu H, Ogawa E, Yotani N, Irie R, Kosaki R, Kosaki K, Uchiyama T, Onodera M, Kawai T.
  • 雑誌名: J Clin Immunol. 巻: 41(5) ページ: 967-974
  • DOI: 10.1007/s10875-021-00977-w.
  • 査読あり
• [雑誌論文] A Distinct Feature of T Cell Subpopulations in a Patient with CHARGE Syndrome and Omenn Syndrome. (2021)
  • 著者名/発表者名: Uchiyama T, Kawakami S, Masuda H, Yoshida K, Niizeki H, Mochizuki E, Edasawa K, Ishiguro A, Onodera M.
  • 雑誌名: J Clin Immunol 巻: 41(1) ページ: 233-237
  • DOI: 10.1007/s10875-020-00875-7
  • 査読あり
• [学会発表] アデノシン・デアミナーゼ欠損症における酵素補充療法による免疫再構築の評価, (2022)
  • 著者名/発表者名: 内山徹、山田雅文、宮村能子、小野寺雅史
  • 学会等名: 第5回日本免疫不全・自己炎症学会総会・学術集会
• [学会発表] 新生児スクリーニングにて発見され、迅速に酵素補充療法を導入したアデノシン・デアミナーゼ欠損症の一例 (2022)
  • 著者名/発表者名: 内山徹、岡井真史、坂口大俊、坂本淳、馬場みのり、田中英、入月浩美、長崎啓佑、石川尊士、井口晶裕、河合利尚、今井千速、富澤大輔、小野寺雅史
  • 学会等名: 第5回日本免疫不全・自己炎症学会総会・学術集会
• [学会発表] Progress of gene therapy for primary immunodeficiency diseases. (2021)
  • 著者名/発表者名: 内山徹
  • 学会等名: 第27回日本遺伝子細胞治療学会学術集会
• [学会発表] 原発性免疫不全症へのゲノム編集による遺伝子治療法の開発 (2021)
  • 著者名/発表者名: 内山徹
  • 学会等名: 日本ゲノム編集学会第６回大会