| 研究課題/領域番号 |
19K08320
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
田中 孝之 京都大学, 医学研究科, 医員 (20625678)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | 遺伝子変異の機能比較 / インフラマソーム / 細胞死 |
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| 研究実績の概要 |
H31-32年度に計画していた、様々なMEFV変異を分類する研究から開始した。当初はiPS細胞を数か月かけて遺伝子改変し、その後1か月かけて単球前駆細胞へ、さらに1週間かけてiPS細胞由来マクロファージへ分化させて機能評価を行う計画であった。しかし、本法では目的のマクロファージを得るまでに長時間を要し、付随して培養液やサイトカインなどのコストがかさむため、予定した期間内・予算内で比較できるMEFV変異の数が限られてしまうことが懸念された。そこで、より多くのMEFV変異を効率的に比較できるよう、短時間で実施可能なMEFV変異の機能評価系を確立することを目指した。
競合研究者から、家族性地中海熱患者で認められる変異MEFV遺伝子がコードする変異pyrin蛋白は、野生型pyrin蛋白とは異なりUCN-01処理による脱リン酸化のみで病的な活性化を来すことが報告された。そこで、我々はより簡便な強制発現系で同様の現象が再現可能かを確認した。具体的には、野生型pyrinないし変異pyrin（M694I）を単球系細胞株であるTHP-1にエレクトロポレーション法で強制発現させてUCN-01処理を行い、変異pyrin発現細胞においてのみ過剰なinflammasome活性化が生じるか検討した。その結果、変異pyrin発現細胞は野生型pyrin発現細胞と比較して、UCN-01処理によるinflammasome過剰活性化から細胞死亢進を来すことが判明し、病原性評価に有用であることが確認された。本アッセイは10時間程度で実施可能であり、従来法と比較して迅速に、かつ多数の変異pyrinの病原性を評価することが可能となった。現在、様々な変異pyrin発現プラスミドを作成途中であり、順次、病原性の評価を行っていく予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
当初の計画に比べて、より短時間の実験で、変異MEFVを評価する系を作成しており、ポジティブコントロールを用いてこの系の妥当性を確認できているため。
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| 今後の研究の推進方策 |
様々なMEFV変異を評価する実験系については、新しく作成した細胞株でのMEFV評価系を用いて、進める。また、H32-33年度に計画していた、MEFV変異によりpyrinとの結合性が変化するタンパクの同定については、当初の計画通りiPS細胞由来マクロファージを用いて実験を進める。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
当初の計画では変異MEFVの機能比較を行う際にiPS細胞由来マクロファージを用いる予定であった。iPS細胞の維持、およびマクロファージ分化には500ml当たり2万円程度の培養液が必要となるため、当初提出した金額の研究費を使用する予定としていた。しかし、単球系細胞株を用いることで、より短期間で変異MEFVの評価が可能となったために、当初の計画ほどは培養液を含めた実験用の消耗品に研究費がかからなかった。
当初は個々の変異MEFV評価にかかる費用が高いために、限られた数の変異を評価する予定としていた。しかし今回、効率の良い比較法を開発でき、研究費に余裕ができたことを生かして、当初の計画より多い数の変異MEFVを比較することを計画している。
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